動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留檢測的固相萃取方法
（Copure® HLB）
一、實驗目的
本法為以Copure® HLB(60mg/3mL)柱開發(fā)的針對動物源食品(豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品)中硝基呋喃類代謝物殘留檢測的樣本前處理凈化方法，HPLC法作為檢測手段。Copure® HLB(60mg/3mL)柱凈化效果良好，回收率滿足測試要求，重現(xiàn)性好，與知名廠商同型號柱性能相當。
二、實驗目標物
四種硝基呋喃類代謝物：呋喃它酮代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2- 噁唑烷基酮(縮寫AMOZ, CAS:43056-63-9)、呋喃西林代謝物氨基脲(縮寫SEM, CAS:563-41-7)、呋喃妥因代謝物1-氨基-2-內(nèi)酰脲(縮寫AHD,CAS:2827-56-7)和呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮(縮寫AOZ, AS:80-65-9)。
三、應用范圍
本方法適用于動物源性食品包括豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品(魚類、蝦蟹類和貝類)中硝基呋喃類代謝物殘留檢測。
四、參考標準
《GB/T 20752-2006 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和《農(nóng)業(yè)部1077號公告-2-2008 水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定》。
五、實驗材料
Biocomma®Copure® HLB固相萃取柱60mg/3mL(Cat.No.COHLB360)；W品牌HLB固相萃取柱60mg/3mL。
六、實驗方法
1、樣品待測溶液制備
(1)樣品稱取脫脂
稱取待測樣品2 g(精確到0.01 g)，置于50 mL離心管中加入10 mL甲醇-水混合物(2:1)，振蕩混勻10 min，4000 r/min離心10 min，吸取清液棄掉、離心管中試樣備用。
(2)水解衍生化
向上述離心管中加入20 mL0.2 mol/L鹽酸，振蕩混勻10 min，后加入0.4 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛(0.075 g2-硝基苯甲醛溶于10 mL 二甲亞砜)，渦旋混勻1 min，置于37 ℃恒溫振蕩器水浴中避光反應16h。將上述衍生液，放置至室溫，加入5 mL0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到約7.4，4000 r/min離心10 min，上清液(對脂肪含量多的試樣，可加入5 mL正己烷，振蕩2 min，4000 r/min離心5 min吸取并棄掉正己烷)待凈化。
2、SPE柱凈化
(1)活化：依次用5 mL甲醇、10 mL水活化。
(2)上樣和洗脫：取上述備用液控制流速小于2 mL/min過柱。待樣液全部通過后用10 mL水淋洗上樣柱，棄去全部流出液并真空抽干，用5 mL乙酸乙酯洗脫柱子上的待測成分。
(3)重新溶解：收集洗脫液，于40 ℃氮氣吹干，準確加入1 mL 乙腈/水(1:2, v/v)溶液溶解殘余物混勻，0.22 µm濾膜過濾，供高效液相色譜測定。
3、HPLC條件
設(shè)備：Waters Alliance 2690
色譜柱：Welch Ultimate XB-C18 (250×4.6mm，5 µm)
檢測器：Waters 2487 雙波長檢測器；檢測波長：275nm
流動相：A:乙腈
B:0.01mol/L乙酸銨（0.77g乙酸銨，1000 mL水溶解，甲酸調(diào)pH 3.5 ）
洗脫方式：梯度洗脫
表1 洗脫梯度條件
柱溫：30 ℃
流速：1.0 mL/min
進樣量：20 µL
七、實驗結(jié)果
1、添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結(jié)果
表2 添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結(jié)果
表3 W品牌同型號柱，添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結(jié)果
2、添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的紫外檢測色譜圖
圖1 添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的紫外檢測色譜圖
