中國農大新聞網訊 近日，植物保護學院周濤團隊在《科學進展》（Science Advances）雜志上發(fā)表了題為“Maize splicing-mediated mRNA surveillance impeded by sugarcane mosaic virus-coded pathogenic protein NIa-Pro”的研究論文，揭示了玉米剪接因子ZmU2AF65B調控mRNA監(jiān)測通路及其被病毒蛋白阻遏的機制。該研究圍繞玉米矮花葉病發(fā)生的分子機理，以主要病原物甘蔗花葉病毒（SCMV）編碼的致病蛋白——核內含體蛋白酶NIa-Pro作為“探測器”，揭示了玉米中剪接因子ZmU2AF65B對mRNA監(jiān)測通路的調控機制，并發(fā)現(xiàn)NIa-Pro通過抑制ZmU2AF65B-ZmUPF3分子模塊的功能進而削弱了mRNA監(jiān)測通路，從而有利于病毒侵染。
轉錄后加工是真核生物基因表達過程中的一個關鍵步驟。在這一階段，轉錄本容易受到細胞內外多種因素的影響，導致RNA發(fā)生異常修飾、剪接錯誤或斷裂等問題。為避免有害多肽的產生，真核細胞依賴mRNA監(jiān)測通路來識別和降解錯誤加工的mRNA。因此，該通路在調控基因表達中起重要作用。先前的研究已經基本揭示了mRNA監(jiān)測通路的工作機理，但對其調控機制的理解還很有限。
mRNA監(jiān)測通路是一個依賴于核糖體翻譯起始的mRNA質控過程，其下游主要包括三個分支：無義介導的mRNA衰變（NMD）、停滯介導的mRNA衰變（NGD）和非終止介導的mRNA衰變（NSD）。具體來說，當核糖體在第一輪翻譯過程中遇到提前終止密碼子（PTC）或因特定RNA結構而停滯時，會分別激活NMD或NGD。許多病毒產生的RNA中也含有PTC和/或特定的RNA基序，使得它們容易成為NMD和/或NGD的靶標。因此，由mRNA監(jiān)測通路介導的病毒RNA降解被認為是一種廣譜的抗病毒機制。此外，異常剪接的轉錄本中通常包含PTC或具有長的3'UTR、uORF或特定的RNA結構，這些特征使得它們被mRNA監(jiān)測通路識別和清除。但有意思的是，在一些剪接體功能異常的突變體植物中，mRNA監(jiān)測通路的靶標轉錄本會出現(xiàn)明顯累積，暗示了剪接因子可能在調控mRNA監(jiān)測通路中發(fā)揮作用。同時，病原物侵染使得寄主細胞中剪接體功能異常后，也能觀察到大量具有PTC等特征的可變剪接轉錄本的累積。在此種背景下，進一步使用病原物效應子來探究pre-mRNA剪接過程是否以及如何調控mRNA監(jiān)測通路將十分有意義。
前期，該團隊發(fā)現(xiàn)SCMV侵染引起的可變剪接轉錄本的變化具有促進病毒侵染的作用（Du et al., Plant Physiology, 2020, 184: 1514-1531）。為進一步理解SCMV調控可變剪接的機制，該研究中利用TurboID鄰近標記結合液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）的方法，篩選了多個與NIa-Pro潛在互作的剪接因子；進一步通過可變剪接報告系統(tǒng)、互作驗證及內源剪接因子表達沉默實驗，證實了SCMV編碼的NIa-Pro通過與ZmU2AF65B的互作，進而操縱RNA剪接。
隨后，利用Iso-Seq技術，該研究發(fā)現(xiàn)Zmu2af65b功能缺失突變體（d2）中mRNA監(jiān)測通路基因的可變剪接發(fā)生紊亂，且靶標轉錄本累積明顯，初步揭示了ZmU2AF65B通過可變剪接正調控mRNA監(jiān)測通路。通過與SCMV侵染的玉米中發(fā)生可變剪接變化的轉錄本進行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在SCMV侵染的玉米或d2突變體中，mRNA監(jiān)測途徑的6個主要基因（包括ZmUPF3）的轉錄本有類似的可變剪接變化。已有研究表明UPF3通過作用于外顯子連接復合物（EJC）在mRNA監(jiān)測通路的起始階段發(fā)揮重要作用，并在后續(xù)的NMD分支中作為核心組分；擬南芥中的NMD途徑通過靶向AtUPF3產生的具有長3'-UTR的轉錄本來調節(jié)AtUPF3的mRNA水平，從而保證mRNA監(jiān)測通路的功能不會過強或者太弱（負反饋循環(huán)）。有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)在WT玉米中，ZmUPF3通過“內含子保留”而產生具有長3'-UTR的轉錄本；但在d2植株中不僅產生更少類型的ZmUPF3可變剪接轉錄本，而且不產生具有長3'-UTR的轉錄本，從而破壞了ZmUPF3的負反饋循環(huán)。鑒于上述這些重要發(fā)現(xiàn)，該研究之后聚焦到了ZmUPF3。通過RNA-EMSA和MST等實驗證實了ZmU2AF65B可以直接結合ZmUPF3的pre-mRNA，且主要與3‘剪接位點附近的尿嘧啶富集串進行結合，而且對尿嘧啶富集程度更高的內含子的結合能力更強，進而保證ZmUPF3轉錄本的正常可變剪接模式，實現(xiàn)對mRNA監(jiān)測通路的正調控。
同時，該研究通過在ZmUPF3表達沉默植株和Zmu2af65b功能缺失突變體中進行侵染性實驗，以及基因功能回補實驗，證實了ZmU2AF65B-ZmUPF3是一個抗病毒分子模塊。此外，通過互作實驗、剪接報告系統(tǒng)、突變體病毒侵染以及回補實驗，證實了SCMV編碼的NIa-Pro通過結合ZmU2AF65B的RRM結構域，破壞了ZmU2AF65B的RNA剪接調控功能，從而抑制了由ZmU2AF65B-ZmUPF3分子模塊以及mRNA監(jiān)測通路介導抗病毒作用，最終有利于病毒侵染。
中國農業(yè)大學植保學院博士后杜開通（入選我校首批興農青年學者）為第一作者，周濤教授為通訊作者，植物病毒研究室成員博士生彭得智、王培、姜彤博士、陳曦博士和范在豐教授，荷蘭格羅寧根大學吳季秋博士，華大基因朱亞兵博士和姜三杰博士，山東農業(yè)大學李向東教授，河北農業(yè)大學曹志艷教授為本研究的完成做出了重要貢獻。在本文研究和撰寫過程中得到了清華大學劉玉樂教授、南京農業(yè)大學董莎萌教授、上海師范大學喬永利教授、中國農科院植保所李方方研究員、中國農業(yè)大學王書偉博士、張永亮教授和郭海龍教授的大力幫助和寶貴建議；該研究得到了國家自然科學基金、中國博士后科學基金會和北京市科學基金等基金的資助。
原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adn3010
日期：2024-11-11
轉錄后加工是真核生物基因表達過程中的一個關鍵步驟。在這一階段，轉錄本容易受到細胞內外多種因素的影響，導致RNA發(fā)生異常修飾、剪接錯誤或斷裂等問題。為避免有害多肽的產生，真核細胞依賴mRNA監(jiān)測通路來識別和降解錯誤加工的mRNA。因此，該通路在調控基因表達中起重要作用。先前的研究已經基本揭示了mRNA監(jiān)測通路的工作機理，但對其調控機制的理解還很有限。
mRNA監(jiān)測通路是一個依賴于核糖體翻譯起始的mRNA質控過程，其下游主要包括三個分支：無義介導的mRNA衰變（NMD）、停滯介導的mRNA衰變（NGD）和非終止介導的mRNA衰變（NSD）。具體來說，當核糖體在第一輪翻譯過程中遇到提前終止密碼子（PTC）或因特定RNA結構而停滯時，會分別激活NMD或NGD。許多病毒產生的RNA中也含有PTC和/或特定的RNA基序，使得它們容易成為NMD和/或NGD的靶標。因此，由mRNA監(jiān)測通路介導的病毒RNA降解被認為是一種廣譜的抗病毒機制。此外，異常剪接的轉錄本中通常包含PTC或具有長的3'UTR、uORF或特定的RNA結構，這些特征使得它們被mRNA監(jiān)測通路識別和清除。但有意思的是，在一些剪接體功能異常的突變體植物中，mRNA監(jiān)測通路的靶標轉錄本會出現(xiàn)明顯累積，暗示了剪接因子可能在調控mRNA監(jiān)測通路中發(fā)揮作用。同時，病原物侵染使得寄主細胞中剪接體功能異常后，也能觀察到大量具有PTC等特征的可變剪接轉錄本的累積。在此種背景下，進一步使用病原物效應子來探究pre-mRNA剪接過程是否以及如何調控mRNA監(jiān)測通路將十分有意義。
前期，該團隊發(fā)現(xiàn)SCMV侵染引起的可變剪接轉錄本的變化具有促進病毒侵染的作用（Du et al., Plant Physiology, 2020, 184: 1514-1531）。為進一步理解SCMV調控可變剪接的機制，該研究中利用TurboID鄰近標記結合液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）的方法，篩選了多個與NIa-Pro潛在互作的剪接因子；進一步通過可變剪接報告系統(tǒng)、互作驗證及內源剪接因子表達沉默實驗，證實了SCMV編碼的NIa-Pro通過與ZmU2AF65B的互作，進而操縱RNA剪接。
隨后，利用Iso-Seq技術，該研究發(fā)現(xiàn)Zmu2af65b功能缺失突變體（d2）中mRNA監(jiān)測通路基因的可變剪接發(fā)生紊亂，且靶標轉錄本累積明顯，初步揭示了ZmU2AF65B通過可變剪接正調控mRNA監(jiān)測通路。通過與SCMV侵染的玉米中發(fā)生可變剪接變化的轉錄本進行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在SCMV侵染的玉米或d2突變體中，mRNA監(jiān)測途徑的6個主要基因（包括ZmUPF3）的轉錄本有類似的可變剪接變化。已有研究表明UPF3通過作用于外顯子連接復合物（EJC）在mRNA監(jiān)測通路的起始階段發(fā)揮重要作用，并在后續(xù)的NMD分支中作為核心組分；擬南芥中的NMD途徑通過靶向AtUPF3產生的具有長3'-UTR的轉錄本來調節(jié)AtUPF3的mRNA水平，從而保證mRNA監(jiān)測通路的功能不會過強或者太弱（負反饋循環(huán)）。有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)在WT玉米中，ZmUPF3通過“內含子保留”而產生具有長3'-UTR的轉錄本；但在d2植株中不僅產生更少類型的ZmUPF3可變剪接轉錄本，而且不產生具有長3'-UTR的轉錄本，從而破壞了ZmUPF3的負反饋循環(huán)。鑒于上述這些重要發(fā)現(xiàn)，該研究之后聚焦到了ZmUPF3。通過RNA-EMSA和MST等實驗證實了ZmU2AF65B可以直接結合ZmUPF3的pre-mRNA，且主要與3‘剪接位點附近的尿嘧啶富集串進行結合，而且對尿嘧啶富集程度更高的內含子的結合能力更強，進而保證ZmUPF3轉錄本的正常可變剪接模式，實現(xiàn)對mRNA監(jiān)測通路的正調控。
同時，該研究通過在ZmUPF3表達沉默植株和Zmu2af65b功能缺失突變體中進行侵染性實驗，以及基因功能回補實驗，證實了ZmU2AF65B-ZmUPF3是一個抗病毒分子模塊。此外，通過互作實驗、剪接報告系統(tǒng)、突變體病毒侵染以及回補實驗，證實了SCMV編碼的NIa-Pro通過結合ZmU2AF65B的RRM結構域，破壞了ZmU2AF65B的RNA剪接調控功能，從而抑制了由ZmU2AF65B-ZmUPF3分子模塊以及mRNA監(jiān)測通路介導抗病毒作用，最終有利于病毒侵染。
中國農業(yè)大學植保學院博士后杜開通（入選我校首批興農青年學者）為第一作者，周濤教授為通訊作者，植物病毒研究室成員博士生彭得智、王培、姜彤博士、陳曦博士和范在豐教授，荷蘭格羅寧根大學吳季秋博士，華大基因朱亞兵博士和姜三杰博士，山東農業(yè)大學李向東教授，河北農業(yè)大學曹志艷教授為本研究的完成做出了重要貢獻。在本文研究和撰寫過程中得到了清華大學劉玉樂教授、南京農業(yè)大學董莎萌教授、上海師范大學喬永利教授、中國農科院植保所李方方研究員、中國農業(yè)大學王書偉博士、張永亮教授和郭海龍教授的大力幫助和寶貴建議；該研究得到了國家自然科學基金、中國博士后科學基金會和北京市科學基金等基金的資助。
原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adn3010
日期：2024-11-11
