2023年1月，華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院黃耀偉教授課題組以華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)廣東省實驗室為第一單位，在國際病毒學權(quán)威雜志Journal of Virology在線發(fā)表題為“Chicken or porcine aminopeptidase N mediates cellular entry of pseudoviruses carrying spike glycoprotein from the avian deltacoronaviruses HKU11, HKU13, and HKU17”的文章（鏈接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.01947-22），首次報道表達三種代表性野禽丁型冠狀病毒（Deltacoronavirus, DCoV）——HKU11, HKU13或HKU17 的刺突蛋白（Spike）的假病毒可分別通過雞或豬氨基肽酶N（APN）介導入侵相應(yīng)種屬的細胞，揭示自然界種類繁多的野禽DCoVs具備潛在的野禽到家禽、以及鳥類到哺乳類的跨物種傳播能力。
依據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）的分類，目前冠狀病毒科成員分為Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus, Deltacoronavirus四個屬，其中DCoV又分為Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus三個亞屬并包含七個種。DCoV主要感染約30個科，108個屬的不同種類野禽，具有廣泛的演化多樣性和復雜的宿主生態(tài)學特征，但極少受到研究人員關(guān)注。鑒定宿主受體是研究冠狀病毒入侵細胞與跨種傳播機制的關(guān)鍵。目前沒有一種野禽DCoV被分離培養(yǎng)出來，對其入侵細胞受體也不清楚。
在DCoV的Buldecovirus亞屬中，豬丁型冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV，或稱HKU15）是唯一一種感染哺乳類的成員，屬于新發(fā)豬腸道冠狀病毒的一種，近年來已在中國、東南亞、北美洲等區(qū)域引發(fā)豬場新生仔豬腹瀉疫情，造成養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟損失。新冠疫情爆發(fā)以來，在海地的三名發(fā)熱兒童中檢測到PDCoV核酸，其序列分別屬于北美譜系與中國譜系，表明PDCoV可能已經(jīng)從動物外溢至人類。
自2013年起，黃耀偉課題組一直致力于幾種新發(fā)與再現(xiàn)豬腸道冠狀病毒，包括PDCoV的基礎(chǔ)研究。在2018年率先報道豬APN為PDCoV的主要入侵細胞受體（Journal of Virology, 2018, 92:e00318-18）；進一步鑒定出其它四個不同種屬（人、小鼠、貓、雞）APN也可以介導PDCoV進入細胞，并且另一種宿主因子唾液酸參與PDCoV刺突蛋白S1亞基的受體結(jié)合與病毒中和作用（Journal of Virology, 2021, 95:e01118-21）。受以上結(jié)果啟發(fā)，課題組進一步猜想可能會有特定種類的野禽DCoVs（如Buldecovirus亞屬成員）也利用APN入侵細胞。
本研究首先分析了DCoV Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus三個亞屬成員的S和S1 氨基酸序列，系統(tǒng)演化構(gòu)建結(jié)果顯示Buldecovirus亞屬分為迥異的兩組（G1及G2），其中夜鶯DCoV HKU11、文鳥DCoV HKU13、美國麻雀DCoV ISU42824與PDCoV同屬于G1；而G2包括中國麻雀DCoV HKU17、中東的獵鷹DCoV HKU27、鴇DCoV HKU28與鴿子DCoV HKU29。G1組的分型與基于復制酶RdRp的Buldecovirus分型一致，但G2組則更接近Herdecovirus亞屬（圖A和圖B）。因此，Buldecovirus G2組成員很可能是在病毒演化過程中來自于G1組（提供全長基因組骨架）與Herdecovirus亞屬（提供并取代了G1的S基因）的重組產(chǎn)物，從而兩種在中國香港和美國分別鑒定的麻雀DCoV有不同的進化路徑。與之相應(yīng)，同源建模分析HKU11和HKU13的RBM結(jié)構(gòu)更接近已知的PDCoV，而HKU17的RBM則與PDCoV有較大區(qū)別。
進一步的免疫共沉淀實驗顯示，HKU11、HKU13、HKU17的S1與雞APN（chAPN）或豬pAPN（pAPN）可以相互作用；流式細胞分析顯示，以上的S1純化蛋白可以在細胞表面結(jié)合穩(wěn)定表達chAPN 或pAPN的PDCoV非易感細胞，以及結(jié)合內(nèi)源表達chAPN 或pAPN的雞細胞或豬細胞。制備攜帶這些DCoV S蛋白（包括來自ISU42824的S）的假型慢病毒可以分別感染穩(wěn)定表達chAPN 或pAPN的非易感細胞與內(nèi)源表達chAPN 或pAPN的雞細胞或豬細胞。而敲除chAPN 或pAPN后，這些假病毒對相應(yīng)的敲除雞細胞系或豬細胞系的入侵水平顯著下降或幾乎消失（圖C,和圖D）。最后，與此前報道的PDCoV感染細胞結(jié)果類似（Emerging Microbes & Infections, 2020, 9:457-468），加入胰酶可以顯著促進這些假病毒入侵豬腸道上皮細胞（圖E）。以上結(jié)果表明，夜鶯 HKU11、文鳥HKU13、以及兩種麻雀DCoV（來自美國的ISU42824與來自中國香港的HKU17），均有可能利用chAPN 或pAPN作為受體入侵細胞，盡管HKU17的S蛋白在進化上與PDCoV及ISU42824有較大差異。
本研究對此前極少關(guān)注的野禽丁型冠狀病毒病原生態(tài)學及跨種傳播潛力進行了分析，首次揭示了不同DCoVs在其野禽宿主之間交叉?zhèn)鞑サ墓餐肿踊A(chǔ)。同時，這也是課題組過去幾年持續(xù)對PDCoV入侵細胞和跨種傳播分子機制進行原創(chuàng)研究的延續(xù)。鑒于野禽DCoVs的多樣性（可能不亞于蝙蝠類CoVs），以及已有PDCoV跨種傳播的先例（據(jù)分子鐘分析推測，PDCoV與麻雀DCoV ISU42824成員同源，大約在上世紀九十年代初從麻雀跳躍到豬，并最后外溢至人類），這一大類冠狀病毒將來是否從各自的野禽宿主，繼續(xù)外溢至家禽和哺乳類，值得關(guān)注和進一步監(jiān)測。
黃耀偉教授為論文通訊作者。本研究受廣東省嶺南實驗室科研項目（NG2022001）、國家自然科學基金-廣東省區(qū)域創(chuàng)新聯(lián)合基金重點項目（U22A20521） 及浙江省自然科學基金重點項目（LZ22C180002）資助。研究工作得到了獸醫(yī)學院馮耀宇教授、哈爾濱獸醫(yī)研究所湯艷東研究員的大力支持和協(xié)助。
日期：2023-02-13
依據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）的分類，目前冠狀病毒科成員分為Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus, Deltacoronavirus四個屬，其中DCoV又分為Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus三個亞屬并包含七個種。DCoV主要感染約30個科，108個屬的不同種類野禽，具有廣泛的演化多樣性和復雜的宿主生態(tài)學特征，但極少受到研究人員關(guān)注。鑒定宿主受體是研究冠狀病毒入侵細胞與跨種傳播機制的關(guān)鍵。目前沒有一種野禽DCoV被分離培養(yǎng)出來，對其入侵細胞受體也不清楚。
在DCoV的Buldecovirus亞屬中，豬丁型冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV，或稱HKU15）是唯一一種感染哺乳類的成員，屬于新發(fā)豬腸道冠狀病毒的一種，近年來已在中國、東南亞、北美洲等區(qū)域引發(fā)豬場新生仔豬腹瀉疫情，造成養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟損失。新冠疫情爆發(fā)以來，在海地的三名發(fā)熱兒童中檢測到PDCoV核酸，其序列分別屬于北美譜系與中國譜系，表明PDCoV可能已經(jīng)從動物外溢至人類。
自2013年起，黃耀偉課題組一直致力于幾種新發(fā)與再現(xiàn)豬腸道冠狀病毒，包括PDCoV的基礎(chǔ)研究。在2018年率先報道豬APN為PDCoV的主要入侵細胞受體（Journal of Virology, 2018, 92:e00318-18）；進一步鑒定出其它四個不同種屬（人、小鼠、貓、雞）APN也可以介導PDCoV進入細胞，并且另一種宿主因子唾液酸參與PDCoV刺突蛋白S1亞基的受體結(jié)合與病毒中和作用（Journal of Virology, 2021, 95:e01118-21）。受以上結(jié)果啟發(fā)，課題組進一步猜想可能會有特定種類的野禽DCoVs（如Buldecovirus亞屬成員）也利用APN入侵細胞。
本研究首先分析了DCoV Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus三個亞屬成員的S和S1 氨基酸序列，系統(tǒng)演化構(gòu)建結(jié)果顯示Buldecovirus亞屬分為迥異的兩組（G1及G2），其中夜鶯DCoV HKU11、文鳥DCoV HKU13、美國麻雀DCoV ISU42824與PDCoV同屬于G1；而G2包括中國麻雀DCoV HKU17、中東的獵鷹DCoV HKU27、鴇DCoV HKU28與鴿子DCoV HKU29。G1組的分型與基于復制酶RdRp的Buldecovirus分型一致，但G2組則更接近Herdecovirus亞屬（圖A和圖B）。因此，Buldecovirus G2組成員很可能是在病毒演化過程中來自于G1組（提供全長基因組骨架）與Herdecovirus亞屬（提供并取代了G1的S基因）的重組產(chǎn)物，從而兩種在中國香港和美國分別鑒定的麻雀DCoV有不同的進化路徑。與之相應(yīng)，同源建模分析HKU11和HKU13的RBM結(jié)構(gòu)更接近已知的PDCoV，而HKU17的RBM則與PDCoV有較大區(qū)別。
進一步的免疫共沉淀實驗顯示，HKU11、HKU13、HKU17的S1與雞APN（chAPN）或豬pAPN（pAPN）可以相互作用；流式細胞分析顯示，以上的S1純化蛋白可以在細胞表面結(jié)合穩(wěn)定表達chAPN 或pAPN的PDCoV非易感細胞，以及結(jié)合內(nèi)源表達chAPN 或pAPN的雞細胞或豬細胞。制備攜帶這些DCoV S蛋白（包括來自ISU42824的S）的假型慢病毒可以分別感染穩(wěn)定表達chAPN 或pAPN的非易感細胞與內(nèi)源表達chAPN 或pAPN的雞細胞或豬細胞。而敲除chAPN 或pAPN后，這些假病毒對相應(yīng)的敲除雞細胞系或豬細胞系的入侵水平顯著下降或幾乎消失（圖C,和圖D）。最后，與此前報道的PDCoV感染細胞結(jié)果類似（Emerging Microbes & Infections, 2020, 9:457-468），加入胰酶可以顯著促進這些假病毒入侵豬腸道上皮細胞（圖E）。以上結(jié)果表明，夜鶯 HKU11、文鳥HKU13、以及兩種麻雀DCoV（來自美國的ISU42824與來自中國香港的HKU17），均有可能利用chAPN 或pAPN作為受體入侵細胞，盡管HKU17的S蛋白在進化上與PDCoV及ISU42824有較大差異。
本研究對此前極少關(guān)注的野禽丁型冠狀病毒病原生態(tài)學及跨種傳播潛力進行了分析，首次揭示了不同DCoVs在其野禽宿主之間交叉?zhèn)鞑サ墓餐肿踊A(chǔ)。同時，這也是課題組過去幾年持續(xù)對PDCoV入侵細胞和跨種傳播分子機制進行原創(chuàng)研究的延續(xù)。鑒于野禽DCoVs的多樣性（可能不亞于蝙蝠類CoVs），以及已有PDCoV跨種傳播的先例（據(jù)分子鐘分析推測，PDCoV與麻雀DCoV ISU42824成員同源，大約在上世紀九十年代初從麻雀跳躍到豬，并最后外溢至人類），這一大類冠狀病毒將來是否從各自的野禽宿主，繼續(xù)外溢至家禽和哺乳類，值得關(guān)注和進一步監(jiān)測。
黃耀偉教授為論文通訊作者。本研究受廣東省嶺南實驗室科研項目（NG2022001）、國家自然科學基金-廣東省區(qū)域創(chuàng)新聯(lián)合基金重點項目（U22A20521） 及浙江省自然科學基金重點項目（LZ22C180002）資助。研究工作得到了獸醫(yī)學院馮耀宇教授、哈爾濱獸醫(yī)研究所湯艷東研究員的大力支持和協(xié)助。
日期：2023-02-13
