南湖新聞網(wǎng)訊 近日， 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳改良團(tuán)隊(duì)教授金雙俠和山東棉花研究中心遺傳育種團(tuán)隊(duì)研究員柳展基在國際期刊Plant Biotechnology Journal合作發(fā)表了題為“High oleic acid content, nontransgenic allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L.） generated by knockout of GhFAD2 genes with CRISPR/Cas9 system”的研究論文，介紹了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因高油酸棉花新種質(zhì)的研究結(jié)果。
作為單不飽和脂肪酸，油酸具有較高的穩(wěn)定性，在烹調(diào)過程中不易產(chǎn)生反式脂肪酸，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)界譽(yù)為“安全脂肪酸”。市場(chǎng)上常見的橄欖油和茶籽油，油酸含量均達(dá)到70%以上，但價(jià)格較為昂貴。高油酸花生來源于自然突變體F435或誘變突變體，油酸含量高達(dá)80%。2017年魯花集團(tuán)推出高油酸花生油，其價(jià)格約為普通花生油的2倍，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、無反式脂肪酸，贏得了消費(fèi)者的青睞。杜邦先鋒公司發(fā)布的Plenish高油酸大豆是利用TALEN基因編輯技術(shù)獲得的，與傳統(tǒng)大豆相比，其油酸含量由21%提高至76.5%，亞油酸含量由52.5%降至3.6%，亞麻酸含量也顯著降低。這使得Plenish高油酸大豆的脂肪酸組成與橄欖油和茶籽油更加接近，被貼以“用大豆生產(chǎn)橄欖油”的標(biāo)簽，其價(jià)格也相應(yīng)地大幅提高。
棉籽油是我國第五大食用植物油，其油酸含量較低，為14.7%-21.7%；而亞油酸含量較高，為46.7%-58.2%。盡管亞油酸具有降低血液膽固醇、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用，但受其不飽和程度高、性質(zhì)不穩(wěn)定、抗氧化性能較弱、易酸敗、貨架期較短等因素的影響，棉籽油品質(zhì)仍有待提升。
FAD2基因是油脂合成代謝過程中的關(guān)鍵基因，其編碼的Δ12-脂肪酸脫飽和酶催化油酸（C18:1）進(jìn)一步脫飽和形成亞油酸（C18:2）。陸地棉為異源四倍體，其基因組中含有8個(gè)FAD2同源基因，其中GhFAD2-1A/D與擬南芥FAD2基因相似性最高，親緣關(guān)系最近。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GhFAD2-1A/D主要在種子中表達(dá)，尤其在種子發(fā)育中后期，表達(dá)量更高，預(yù)示其在調(diào)控棉花種子油分組成中發(fā)揮的重要作用。
利用CRISPR/Cas9敲除GhFAD2基因創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因高油酸棉花
該研究以棉花GhFAD2-1A/D基因?yàn)榘袠?biāo)，分別在其DUF3474和Fatty acid desaturase結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)了2個(gè)靶點(diǎn)，利用pRGEB32-GhU6.9-NPT II 載體構(gòu)建了GhFAD2-1A/D基因的雙靶點(diǎn)編輯載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花品系Jin668，獲得了35株獨(dú)立的T0代再生植株。經(jīng)PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)25株（71.43%）含有編輯載體上的NPTII和Cas9基因。利用Sanger測(cè)序檢測(cè)產(chǎn)生的突變，研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)靶點(diǎn)均有突變發(fā)生。在25株陽性獨(dú)立植株中，有19株（有效率76%）在目標(biāo)位點(diǎn)檢測(cè)到突變。突變類型以單堿基插入缺失為主，同時(shí)也檢測(cè)到了長(zhǎng)片段堿基缺失，為2個(gè)sgRNA共同作用的結(jié)果。利用PCR和Sanger測(cè)序檢測(cè)T1植株，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)所有T0突變均穩(wěn)定遺傳到T1代，T1代中也發(fā)現(xiàn)了新的突變。尤為重要的是，在T1代中檢測(cè)到了4個(gè)無載體篩選標(biāo)記基因的突變單株，被稱為非轉(zhuǎn)基因（nontransgenic）突變株。棉花基因組中含有21個(gè)GhFAD成員，團(tuán)隊(duì)利用Sanger測(cè)序詳細(xì)分析了19個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，結(jié)果未檢測(cè)到脫靶效應(yīng)；利用GC-MS分析了4個(gè)非轉(zhuǎn)基因突變單株種子的脂肪酸組分，與對(duì)照J(rèn)in668相比，突變體種子中的油酸含量顯著升高，亞油酸含量顯著降低。本研究還檢測(cè)了高油酸突變體的主要農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)敲除GhFAD2-1A/D基因并不影響棉花產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、種子總油分含量和種子萌發(fā)率。
金雙俠和柳展基為本論文的通訊作者，山東棉花研究中心博士陳義珍為第一作者，山東棉花研究中心傅明川、李浩、王立國和劉任重以及我校張獻(xiàn)龍教授也參與了這項(xiàng)工作。該研究受到了國家自然科學(xué)基金和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程的支持。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13507
日期：2020-11-05
作為單不飽和脂肪酸，油酸具有較高的穩(wěn)定性，在烹調(diào)過程中不易產(chǎn)生反式脂肪酸，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)界譽(yù)為“安全脂肪酸”。市場(chǎng)上常見的橄欖油和茶籽油，油酸含量均達(dá)到70%以上，但價(jià)格較為昂貴。高油酸花生來源于自然突變體F435或誘變突變體，油酸含量高達(dá)80%。2017年魯花集團(tuán)推出高油酸花生油，其價(jià)格約為普通花生油的2倍，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、無反式脂肪酸，贏得了消費(fèi)者的青睞。杜邦先鋒公司發(fā)布的Plenish高油酸大豆是利用TALEN基因編輯技術(shù)獲得的，與傳統(tǒng)大豆相比，其油酸含量由21%提高至76.5%，亞油酸含量由52.5%降至3.6%，亞麻酸含量也顯著降低。這使得Plenish高油酸大豆的脂肪酸組成與橄欖油和茶籽油更加接近，被貼以“用大豆生產(chǎn)橄欖油”的標(biāo)簽，其價(jià)格也相應(yīng)地大幅提高。
棉籽油是我國第五大食用植物油，其油酸含量較低，為14.7%-21.7%；而亞油酸含量較高，為46.7%-58.2%。盡管亞油酸具有降低血液膽固醇、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用，但受其不飽和程度高、性質(zhì)不穩(wěn)定、抗氧化性能較弱、易酸敗、貨架期較短等因素的影響，棉籽油品質(zhì)仍有待提升。
FAD2基因是油脂合成代謝過程中的關(guān)鍵基因，其編碼的Δ12-脂肪酸脫飽和酶催化油酸（C18:1）進(jìn)一步脫飽和形成亞油酸（C18:2）。陸地棉為異源四倍體，其基因組中含有8個(gè)FAD2同源基因，其中GhFAD2-1A/D與擬南芥FAD2基因相似性最高，親緣關(guān)系最近。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GhFAD2-1A/D主要在種子中表達(dá)，尤其在種子發(fā)育中后期，表達(dá)量更高，預(yù)示其在調(diào)控棉花種子油分組成中發(fā)揮的重要作用。
利用CRISPR/Cas9敲除GhFAD2基因創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因高油酸棉花
該研究以棉花GhFAD2-1A/D基因?yàn)榘袠?biāo)，分別在其DUF3474和Fatty acid desaturase結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)了2個(gè)靶點(diǎn)，利用pRGEB32-GhU6.9-NPT II 載體構(gòu)建了GhFAD2-1A/D基因的雙靶點(diǎn)編輯載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花品系Jin668，獲得了35株獨(dú)立的T0代再生植株。經(jīng)PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)25株（71.43%）含有編輯載體上的NPTII和Cas9基因。利用Sanger測(cè)序檢測(cè)產(chǎn)生的突變，研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)靶點(diǎn)均有突變發(fā)生。在25株陽性獨(dú)立植株中，有19株（有效率76%）在目標(biāo)位點(diǎn)檢測(cè)到突變。突變類型以單堿基插入缺失為主，同時(shí)也檢測(cè)到了長(zhǎng)片段堿基缺失，為2個(gè)sgRNA共同作用的結(jié)果。利用PCR和Sanger測(cè)序檢測(cè)T1植株，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)所有T0突變均穩(wěn)定遺傳到T1代，T1代中也發(fā)現(xiàn)了新的突變。尤為重要的是，在T1代中檢測(cè)到了4個(gè)無載體篩選標(biāo)記基因的突變單株，被稱為非轉(zhuǎn)基因（nontransgenic）突變株。棉花基因組中含有21個(gè)GhFAD成員，團(tuán)隊(duì)利用Sanger測(cè)序詳細(xì)分析了19個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，結(jié)果未檢測(cè)到脫靶效應(yīng)；利用GC-MS分析了4個(gè)非轉(zhuǎn)基因突變單株種子的脂肪酸組分，與對(duì)照J(rèn)in668相比，突變體種子中的油酸含量顯著升高，亞油酸含量顯著降低。本研究還檢測(cè)了高油酸突變體的主要農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)敲除GhFAD2-1A/D基因并不影響棉花產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、種子總油分含量和種子萌發(fā)率。
金雙俠和柳展基為本論文的通訊作者，山東棉花研究中心博士陳義珍為第一作者，山東棉花研究中心傅明川、李浩、王立國和劉任重以及我校張獻(xiàn)龍教授也參與了這項(xiàng)工作。該研究受到了國家自然科學(xué)基金和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程的支持。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13507
日期：2020-11-05
