細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查法

1、在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑，經(jīng)接種、培養(yǎng)后，觀察培養(yǎng)基的PH值變化。

2、在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細(xì)菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應(yīng)。

3、根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測(cè)定酶的存在。

4、根據(jù)細(xì)菌對(duì)理化條件和藥品的敏感性，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

生化試驗(yàn)的注意事項(xiàng)

1、待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18-24h。

2、待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。

3、遵守觀察反應(yīng)的時(shí)間。觀察結(jié)果的時(shí)間，多為24或48小時(shí)。

4、應(yīng)做必要的對(duì)照試驗(yàn)。

5、提高陽性檢出率，至少挑取2-3個(gè)待檢的疑似菌落分別進(jìn)行試驗(yàn)。

生化試驗(yàn)分類

（一）糖類代謝試驗(yàn)

（二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)

（三）有機(jī)酸鹽和銨鹽代謝試驗(yàn)

（四）酶類試驗(yàn)

原理  糖類是作為碳源和能量來源提供細(xì)菌合成菌體成分必需的原料，由于細(xì)菌各自有不同的酶系統(tǒng)，故對(duì)糖(醇)類的分解能力不盡相同。有的能分解某些糖類，生成酸又生成氣體，有的雖能分解這些糖類但只能生成酸不能生成氣體，有的則根本不能分解。借此特點(diǎn)，可以作為鑒定細(xì)菌的依據(jù)之一。該試驗(yàn)檢查細(xì)菌對(duì)加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的特殊的糖發(fā)酵(降解)后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力。

常用的糖、醇

單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、鼠李糖

雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖、蕈糖

三糖：棉子糖

多糖：菊糖、肝糖、淀粉

醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇

方法

(1)試劑：糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，常用的指示劑主要有酚紅、溴麝香草酚藍(lán)、溴甲酚紫和酸性復(fù)紅等。前二者顏色反應(yīng)較敏感，但穩(wěn)定性較差。后二者比較穩(wěn)定。特別是對(duì)發(fā)酵遲緩的細(xì)菌，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，則以后二者為優(yōu)。 

(2)培養(yǎng)基：液體糖發(fā)酵管，半固體糖發(fā)酵管，固體糖發(fā)酵管，雙糖(或三糖)高層斜面發(fā)酵管。

(3)操作：以無菌操作的方法將經(jīng)分離培養(yǎng)的純種細(xì)菌接種到糖(醇)發(fā)酵培養(yǎng)基中，置溫箱內(nèi)，按各類菌所要求溫度(通常為37℃)經(jīng)一定時(shí)間(數(shù)小時(shí)至二周)培養(yǎng)，然后觀察結(jié)果。

結(jié)果

(1)接種的細(xì)菌，如能分解培養(yǎng)基中的糖(醇)類而生成酸，由于培養(yǎng)基內(nèi)加有指示劑，故可使培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)，如產(chǎn)生氣體，則可使半固體培養(yǎng)基內(nèi)或液體培養(yǎng)基中倒置的小管出現(xiàn)氣泡。如若不分解則無任何反應(yīng)。

糖酵解試驗(yàn) 

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。

記錄：

產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“+”表示

產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以“⊕”表示

不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示

(2)在半固體糖發(fā)酵管中，還可以觀察細(xì)菌的動(dòng)力，若為有鞭毛的細(xì)菌，則沿接種線向周圍擴(kuò)散生長(zhǎng)。若為無鞭毛菌，則僅在接種線處生長(zhǎng)。

(3)在雙糖(或三糖)高層斜面發(fā)酵管中，由于葡萄糖含量?jī)H為乳糖或蔗糖的1/10，如細(xì)菌只分解葡萄糖，則斜面上產(chǎn)生的酸少，且易被氧化并因產(chǎn)生氨以及細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)而變?nèi)鯄A性，故斜面變?yōu)榉奂t色，而底層變酸，指示劑變色。若細(xì)菌分解葡萄糖，同時(shí)也分解乳糖或蔗糖時(shí)，則產(chǎn)酸量較多，底層和斜面均呈酸性，指示劑亦變色。若在此培養(yǎng)基中加入硫酸亞鐵或尿素，同時(shí)還可以觀察細(xì)菌產(chǎn)生硫化氫及尿素分解情況。

注意事項(xiàng)

(1)各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基，含糖的濃度一般為5～10g/L，有時(shí)為20g/L。

(2)有些糖類，可因121℃高壓蒸汽滅菌時(shí)水解變質(zhì)，特別是在堿性溶液中更易被破壞，故含糖的培養(yǎng)基常用115℃，15min滅菌。亦可先將糖類單獨(dú)配制成100～200g/L的水溶液，經(jīng)115℃ 15min滅菌后，然后再以無菌操作的方法加入已滅菌的培養(yǎng)基中。此外，還可將糖的溶液用濾菌器進(jìn)行濾過除菌，再加入培養(yǎng)基中。

(3)若應(yīng)用微量發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)注意保持其周圍的濕度，以免培養(yǎng)基干燥。

原理  某些細(xì)菌分解葡萄糖的過程中產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步被代謝成為乳酸，乙酸，甲酸等。使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下，加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色為陽性；有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，最終的酸類較少，培養(yǎng)基pH較高，加入甲基紅指示劑呈黃色為陰性反應(yīng)。

因此該試驗(yàn)是檢查細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生并保持穩(wěn)定的酸性終末產(chǎn)物和克服體系緩沖作用的能力，某些細(xì)菌比其他細(xì)菌能夠產(chǎn)生更多的酸。

方法

(1)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水(MR/VP培養(yǎng)基)。

(2)試劑：甲基紅指示劑。

(3)操作：待檢菌18～24h純培養(yǎng)物接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中；37℃培養(yǎng)2～3d，每2ml培養(yǎng)液加2滴甲基紅指示劑，立即觀察。

結(jié)果  

MR陽性：培養(yǎng)物有足夠的酸，能使培養(yǎng)基表面甲基紅試劑仍保持明顯的紅色(pH4.4)；

MR陰性：培養(yǎng)基表面呈黃色(pH6.0)；

延遲反應(yīng)：橙色，應(yīng)繼續(xù)孵育到4天，并重復(fù)試驗(yàn)。

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應(yīng)。

方法(Barritt法)

(1)試劑：甲液為60g/Lα－萘酚酒精溶液；乙液為400g/L KOH溶液.

(2)操作：首先將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，經(jīng)37℃培養(yǎng)4d。再按每2ml培養(yǎng)液中加入甲液lml、乙液0.4ml，充分搖動(dòng)試管，觀察結(jié)果。

結(jié)果  如立即或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色反應(yīng)者為陽性；若為陰性應(yīng)將試管置37℃中4h后再進(jìn)行觀察。

原理  細(xì)菌的酶分為結(jié)構(gòu)酶和適應(yīng)酶。β-半乳糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶，它對(duì)半乳糖苷的作用是特異的。發(fā)酵乳糖的大腸菌類能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶-滲透酶和β-半乳糖苷酶，因此能迅速地(在24～48h內(nèi))分解乳糖，并通過中間產(chǎn)物半乳糖和葡萄糖形成CO2和H2。非乳糖發(fā)酵菌缺少這兩種酶，因此乳糖既不能進(jìn)入菌體，又不能被分解。然而，不能發(fā)酵乳糖的細(xì)菌可呈現(xiàn)兩種表型之一：一是G-P + ，即沒有β-半乳糖苷酶(G)，但有滲透酶(P)，因此不能發(fā)酵半乳糖苷，但能積累半乳糖苷；二是 G+P-，具有β-半乳糖苷酶(G)，但沒有滲透酶(P)。

通過使用有機(jī)化合物鄰位-硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)證明有無β-半乳糖苷酶活性，可預(yù)測(cè)細(xì)菌發(fā)酵乳糖的能力。若有半乳糖苷酶陽性的細(xì)菌存在，無色的ONPG試劑被水解，釋放出黃色化合物鄰位-硝基苯酚(ONP)。陽性β-半乳糖苷酶試驗(yàn)就是基于對(duì)鄰位-硝基苯酚的檢測(cè)。

方法

(1)培養(yǎng)基：10g/L乳糖肉湯瓊脂。

(2)試劑：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液；鄰硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)液。

(3)操作：首先將被檢菌接種到10g/L乳糖肉湯瓊脂上，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，以無菌方法取一接種環(huán)菌置于0.25ml的生理鹽水中做成菌懸液，然后加ONPG液0.25ml，置于37℃溫箱或水浴箱中，分別在20min和3h后觀察結(jié)果。

結(jié)果  

如有β-半乳糖苷酶，一般在20～30min即呈現(xiàn)黃色者為陽性；如無此酶則24h不變色。

原理  某些細(xì)菌(如糞鏈球菌)可水解七葉苷，生成葡萄糖和七葉素(為一種珊瑚狀的白色結(jié)晶)。七葉素可與培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵試劑的二價(jià)鐵離子起反應(yīng)生成黑色的化合物沉淀，使培養(yǎng)基變黑。

方法

(1)培養(yǎng)基：七葉苷培養(yǎng)基。

(2)操作：以無菌方法將試驗(yàn)菌接種到七葉苷瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃ 18～24h培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

結(jié)果  培養(yǎng)基變黑色者為試驗(yàn)陽性。若將糞鏈球菌接種到七葉苷液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃ 4～6h培養(yǎng)，培養(yǎng)基即可。

原理  牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，營(yíng)養(yǎng)豐富，一般細(xì)菌均可在其中生長(zhǎng)。一種細(xì)菌在石蕊牛奶中可表現(xiàn)一種或幾種代謝特性，每種代謝特性對(duì)一個(gè)特定細(xì)菌來說都是特異的。這樣，就有助于細(xì)菌的鑒定：①乳糖發(fā)酵；②石蕊還原；③凝固蛋白；④蛋白陳化(消化)；⑤氣體產(chǎn)生。

有的細(xì)菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌，對(duì)牛乳具有強(qiáng)烈發(fā)酵反應(yīng)，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、凝固、胨化幾乎同時(shí)發(fā)生。所產(chǎn)生的氣體，可將培養(yǎng)基表層的凡士林沖至管口，牛乳可全被胨化變清，這種被稱為“洶涌發(fā)酵”是為該菌所特有。有的細(xì)菌不發(fā)酵乳糖，而分解含氮物質(zhì)，生成氨及胺，使培養(yǎng)基變堿性，石蕊指示劑變藍(lán)紫色。

方法

(1)培養(yǎng)基：石蕊牛乳培養(yǎng)基。

(2)操作：首先將培養(yǎng)基表面的一層凡士林在酒精燈上熔化，然后無菌取被檢菌接種到石蕊牛乳培養(yǎng)基中。接種后將培養(yǎng)基直立，置37℃溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

結(jié)果  

產(chǎn)酸：若發(fā)酵糖產(chǎn)酸，使石蕊指示劑變?yōu)榉奂t色。產(chǎn)氣：若發(fā)酵乳糖同時(shí)產(chǎn)氣者，可沖開覆蓋在培養(yǎng)基上的凡士林。凝固：若發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸甚多，可使酪蛋白凝固。胨化：若將凝固的酪蛋白，繼續(xù)水解成蛋白胨，此時(shí)牛乳培養(yǎng)基的上段則變清。產(chǎn)堿：若不發(fā)酵乳糖，分解含氮物質(zhì)，生成氨及胺，使培養(yǎng)基變堿性，石蕊指示劑變藍(lán)紫色。

不同細(xì)菌分解蛋白質(zhì)能力不同，可利用不同氮源來合成菌體蛋白質(zhì)，可通過檢測(cè)加入蛋白質(zhì)分解代謝后的產(chǎn)物或pH變化鑒定細(xì)菌。 

某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。

方法

(1)培養(yǎng)基：蛋白胨水。

(2)試劑：Kovac試劑；歐氏試劑。

(3)操作：純培養(yǎng)物接種蛋白胨水培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)24～48h，沿管壁徐徐加入Kovac氏試劑或歐氏試劑0.5ml，分為兩層，觀察。

結(jié)果  

兩層液體交界處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。

原理  某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸生成H2S， H2S可與加入培養(yǎng)基中的鉛或鐵離子生成黑色硫化物。

方法與結(jié)果

(1)瓊脂穿刺法：

培養(yǎng)基：三糖鐵培養(yǎng)基、含硫酸亞鐵(或醋酸鉛)的半固體培養(yǎng)基。

操作：將試驗(yàn)細(xì)菌以接種針沿管壁穿刺接種到含醋酸鉛或硫酸亞鐵培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃ 24h培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。

結(jié)果：培養(yǎng)基變黑色為陽性。當(dāng)產(chǎn)生硫化氫量少時(shí)，為了便于觀察結(jié)果，在穿刺接種培養(yǎng)時(shí)，一定要沿培養(yǎng)基管壁進(jìn)行。

(2)醋酸鉛試紙法：

培養(yǎng)基：含胱氨酸的半固體培養(yǎng)基、浸有醋酸鉛的濾紙條。

操作：待檢菌穿刺接種培養(yǎng)基，懸掛醋酸鉛紙條，37℃培養(yǎng)24～48h。

結(jié)果：試紙呈黑色為陽性。該法較敏感。

原理  有些細(xì)菌(如某些變形桿菌)具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨,使培養(yǎng)基pH上升，而變成堿性，使含有酚紅指示劑的培養(yǎng)基變成紅色。

方法

(1)培養(yǎng)基：尿素瓊脂。

(2)操作：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果，如為陰性應(yīng)繼續(xù)觀察4d。

結(jié)果  培養(yǎng)基變紅為陽性，不變?yōu)殛幮浴?i> 

原理  某些細(xì)菌產(chǎn)生明膠酶可使明膠分解，失去凝固力，使其由半固體轉(zhuǎn)化為液體狀態(tài)。天然存在的蛋白質(zhì)分子太大不能進(jìn)入菌體細(xì)胞，因此，細(xì)菌為了利用這些蛋白質(zhì)，首先必須將其分解為較小的組分。某些細(xì)菌分泌細(xì)胞外類蛋白水解酶(明膠酶)來分解蛋白質(zhì)，這種能力有助于細(xì)菌的鑒定。

方法

(1)培養(yǎng)基：明膠培養(yǎng)基

(2)操作：將待檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置對(duì)照管(未接種細(xì)菌)，20℃培養(yǎng)5～7d，觀察。在孵育期間，每24h取出試管(包括含細(xì)菌的試驗(yàn)管相對(duì)照管)放冰箱(或冰浴)內(nèi)約2h，檢查明膠是否已被消化(液化)，每天一次，直到7d，除非發(fā)生液化。有許多菌種要證實(shí)明膠液化需要延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

結(jié)果  半固體培養(yǎng)基不再凝固為陽性。

注意事項(xiàng):

明膠在≤20℃時(shí)為固體，≥35℃時(shí)則為液體。從凝膠(固態(tài))轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w大約在28℃。所以，明膠管在≥35℃下孵育時(shí)，在決定是否液化以前，必須先放在冰箱或冰浴中冷卻一段時(shí)間。因細(xì)菌在培養(yǎng)基的表面生長(zhǎng)引起液化，當(dāng)明膠管還溫?zé)釙r(shí)不要搖動(dòng)，否則液化的明膠與培養(yǎng)基液體混合，由此忽略陽性結(jié)果，造成假陰性。

原理  某些細(xì)菌產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸和游離氨，加入FeCl3試劑與苯丙酮酸螯合后出現(xiàn)綠色產(chǎn)物，隨后綠色可褪去。延長(zhǎng)時(shí)間后，所生成的綠色會(huì)較快褪色。苯丙酮酸如與檸檬酸鐵相遇則產(chǎn)生棕黑色。

方法

(1)培養(yǎng)基：苯丙氨酸培養(yǎng)基。

(2)試劑：100g/L FeCl3溶液。

(3)操作：被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)18～24h，滴加100g/L FeCl3試劑數(shù)滴于斜面上，自上流下觀察。

結(jié)果  須在5min內(nèi)作出判斷，出現(xiàn)綠色為陽性。

(1)賴氨酸：賴氨酸經(jīng)過賴氨酸脫羧酶作用生成尸胺和CO2。

(2)鳥氨酸：鳥氨酸經(jīng)鳥氨酸脫羧酶的脫羧作用，產(chǎn)生腐胺和CO2。

(3)精氨酸：L-精氨酸經(jīng)精氨酸脫羧酶的作用，可產(chǎn)生精胺和CO2。

方法

(1)培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基。

(2)操作：待檢菌接種于氨基酸培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)1～4d。延長(zhǎng)時(shí)間則常有假陽性出現(xiàn)，假陽性系由蛋白胨中其他種氨基酸分解而造成，故必須同時(shí)接種對(duì)照管。

結(jié)果  檢測(cè)培養(yǎng)基由黃色變紫色為陽性，黃色為陰性，對(duì)照(無氨基酸)為黃色。

陽性反應(yīng)試驗(yàn)管顏色變化過程

紫色→黃色→紫色

原理：

  對(duì)照管呈黃色，說明有細(xì)菌生長(zhǎng)。在培養(yǎng)的早期（10~12h），細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)液PH下降，指示劑溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，以后由于氨基酸脫羧生成胺，PH又回升至堿性，指示劑顯紫色。

原理  細(xì)菌分解精氨酸產(chǎn)堿不限于精氨酸脫羧酶。精氨酸雙水解酶可使精氨酸經(jīng)過兩次水解，產(chǎn)生鳥氨酸、兩分子氨和一分子CO2。經(jīng)氣相色譜分析證明，沙門菌分解精氨酸系由于精氨酸雙水解酶，而大腸埃希菌則系由于精氨酸脫羧酶。

方法

(1)培養(yǎng)基：含精氨酸的氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基。

(2)操作：自斜面培養(yǎng)物接種，作腸桿菌科的鑒定時(shí)可覆蓋滅菌的液狀石蠟，作假單胞菌屬的鑒定時(shí)則不能覆蓋液狀石蠟。于37℃培養(yǎng)。

結(jié)果  指示劑顏色轉(zhuǎn)為堿性時(shí)為陽性。即溴甲酚紫轉(zhuǎn)為紫色，酚紅轉(zhuǎn)為紅色。但由培養(yǎng)基pH的改變不能證明是由精氨酸脫羧酶或由精氨酸雙水解酶，欲鑒別應(yīng)作氣相色譜分析。

8. 肉渣消化試驗(yàn)

原理  肉渣消化試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)菌對(duì)蛋白質(zhì)的另一種分解能力。某些梭菌在生長(zhǎng)過程中可將肉渣消化。例如肉毒梭菌有很強(qiáng)的消化能力，皰肉培養(yǎng)基可被消化而呈黑色，有助于和其他梭菌的鑒別。

方法

(1)培養(yǎng)基：皰肉培養(yǎng)基。

(2)操作：試驗(yàn)菌按常規(guī)法接種于皰肉培養(yǎng)基，用蠟筆于培養(yǎng)基的肉渣上緣畫一橫線作為標(biāo)記。于37℃培養(yǎng)數(shù)日。

結(jié)果  觀察管內(nèi)肉渣的高度有無變化，即可判定肉渣是否已被部分消化。 

9. 凝固血清消化試驗(yàn)

原理  某些細(xì)菌液化凝固血清，系由于這些細(xì)菌產(chǎn)生一種胞外蛋白酶的作用所致

方法

(1)培養(yǎng)基：呂氏血清培養(yǎng)基。

(2)操作：取試驗(yàn)細(xì)菌，以無菌方法接種于呂氏血清斜面上，經(jīng)37℃培養(yǎng)數(shù)日，觀察結(jié)果。  

結(jié)果  凝固之血清發(fā)生液化為陽性。

原理  有些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源，能在除檸檬酸鹽外不含其他碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分解檸檬酸鹽，生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變成堿性。

方法

(1)培養(yǎng)基：檸檬酸鹽培養(yǎng)基。

(2)操作：被檢菌接種于檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)l～4d，觀察。

結(jié)果  培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，不變色為陰性。

指示劑為：1%溴麝香草酚藍(lán)(酒精溶液)或0.04%苯酚紅 10mL/1000mL水

用脫脂棉過濾，制成后為黃綠色。

斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{(lán)色或深藍(lán)色，為陽性，記+；

無菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基斜面仍為綠色者，為陰性，記-

三氯化鐵法

原理：B群鏈球菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結(jié)合，形成苯甲酸鐵沉淀.

方法

培養(yǎng)基:馬尿酸鈉培養(yǎng)基。

試劑：三氯化鐵溶液。

操作：待檢菌接種馬尿酸鈉培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)48h，離心沉淀，取上清液0.8mL加入三氯化鐵溶液0.2mL，立即混合均勻，經(jīng)10～15min觀察結(jié)果。

結(jié)果：出現(xiàn)穩(wěn)定的沉淀物為陽性，輕搖后沉淀物溶解為陰性。

茚三酮法

原理：馬尿酸被細(xì)菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。甘氨酸在茚三酮的作用下，經(jīng)氧化脫氨基反應(yīng)，生成氨，CO2和相應(yīng)的醛，而茚三酮?jiǎng)t生成了還原型茚三酮。其中形成的氨和還原型茚三酮，與殘留的茚三酮起反應(yīng)，形成紫色化合物。

方法：

試劑：l％馬尿酸鈉水溶液；3.5g茚三酮溶于100mL的1：1的丙酮，丁酮混合溶液。

操作：0.4ml待檢菌與等量的1％馬尿酸鈉水溶液混合后，35℃培養(yǎng)2h，加入0.2ml茚三酮試劑，振搖后觀察。

結(jié)果：出現(xiàn)紫色為陽性。

原理  某些細(xì)菌利用丙二酸鹽作為唯一碳源時(shí)，丙二酸鈉可被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。

溴麝香草酚藍(lán)：溴麝香草酚藍(lán)是一種酸堿指示劑，變色范圍pH6.0(黃)～7.6(藍(lán))。普通水是中性，pH也就是7左右，差不多呈淡藍(lán)，溶有二氧化碳后，由于會(huì)形成碳酸，碳酸是弱酸，因此pH不會(huì)降太多，變黃。當(dāng)中過渡顏色是綠色。

方法

(1)培養(yǎng)基：丙二酸鈉培養(yǎng)基。

(2)操作：被檢菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。

結(jié)果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性，顏色無變化為陰性。

原理  氧化酶(又稱細(xì)胞色素氧化酶)是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，能使還原型的細(xì)胞色素C氧化成氧化型的細(xì)胞色素C，氧化型細(xì)胞色素C又使對(duì)苯二胺氧化，生成紅色的醌類化合物。

方法

(1)試劑：10g/L鹽酸四甲基對(duì)苯二胺水溶液，或10g/L鹽酸二甲基對(duì)苯二胺水溶液。

(2)操作：取濾紙片蘸取待測(cè)菌落少許，加試劑一滴，觀察顏色變化。也可用滴管吸取試劑，直接將一滴滴在待測(cè)菌菌落上，觀察顏色變化。

結(jié)果：陽性者立即呈現(xiàn)粉紅色或紅色，顏色逐漸變深至深紫色。

原理  過氧化氫酶又稱觸酶，可使細(xì)菌代謝過程中的過氧化氫分解為水和氧。

方法

(1)試劑：新鮮配制的3％過氧化氫水溶液。

(2)操作：挑取1環(huán)固體培養(yǎng)基上的待測(cè)菌菌落，放于潔凈玻片上或試管內(nèi)，滴加3％過氧化氫數(shù)滴，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)時(shí)必須用18～24h新鮮培養(yǎng)物。陳舊培養(yǎng)物可能使觸酶失活，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，不宜挑取血瓊脂上的菌落，因紅細(xì)胞內(nèi)含有觸酶，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

結(jié)果  30s內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，無氣泡產(chǎn)生者為陰性。

原理  某些革蘭氏陰性桿菌在代謝過程中，能將培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)生成重氮苯磺酸，再與α-萘胺結(jié)合，生成紅色的N-α萘胺偶氮苯磺酸。

方法

(1)培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基。

(2)試劑：①甲液：對(duì)氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml；②乙液：α-萘胺0.5g，

5mol/L醋酸100ml。

操作：待測(cè)菌株接種到硝酸鹽培養(yǎng)基中，35℃18～24h培養(yǎng)后，加入0.1ml甲、乙液等量混合液于試管內(nèi)，觀察結(jié)果。

結(jié)果  出現(xiàn)紅色為陽性，無顏色變化為陰性。

（1）原理:過氧化物酶的作用是將過氧化氫中的氧轉(zhuǎn)移給可被氧化的物質(zhì)。

（2）其反應(yīng)如下：試驗(yàn)時(shí)，若以聯(lián)苯胺(4,4-二氨基聯(lián)苯 )作為被氧化的物質(zhì)，試驗(yàn)細(xì)菌如有過氧化物酶存在時(shí)，加入過氧化氫可使苯胺氧化成為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)。

（3）方法

 試劑：鹽酸聯(lián)苯胺溶液；3％過氧化氫溶液。

 操作：將鹽酸聯(lián)苯胺溶液與過氧化氫溶液等量混合后，滴加于菌落上，立即觀察結(jié)果。

（4）結(jié)果

 陽性者于2min內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色。

（1）原理

 細(xì)菌的脫氫酶可使相應(yīng)的作用物脫去氫，但此作用需要一個(gè)可還原的化合物作為受氫體。

 若用美藍(lán)（亞甲藍(lán)，Methylene blue）作為受氫體的話，細(xì)菌如有脫氫酶存在，可使美藍(lán)還原成美白(無色)。但是，美白易被空氣中氧氣所氧化，故此試驗(yàn)應(yīng)在隔絕空氣下進(jìn)行。

 染料、醫(yī)藥、鑒識(shí)血跡

如果用無色TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑 ）作為受氫體，在有脫氫酶存在的情況下，TTC可以接受氫而成為紅色的Formazan（甲臜zā ) 。后者不再被氧氣所氧化，所以試驗(yàn)不必在密閉的條件下進(jìn)行。

（2）方法

 試劑：1︰30000美藍(lán)水溶液；pH7.4磷酸鹽緩沖液；0.1mol／L的作用物水溶液。

 操作：①取試驗(yàn)菌肉湯培養(yǎng)物10ml，離心后以緩沖液洗2次，再加緩沖液5ml，制成菌液。②取試管3支，每管加美藍(lán)水溶液0.5ml，于第1管和第3管各加菌液1ml，第2管加緩沖液1ml，置37℃水浴中15min。③第1管和第2管各加作用物2ml，第3管加緩沖液2ml。④各管加無菌液狀石蠟0.5ml，使覆蓋于液面上。⑤置37℃水浴中，每5min觀察一次，記錄美藍(lán)變白時(shí)間，共觀察2h。

(3)結(jié)果

 若第1管變白即為相應(yīng)作用物的脫氫酶陽性，不變色為陰性。第2管與第3管為對(duì)照管，應(yīng)不變色。

(1)原理

 部分細(xì)菌可還原無色可溶性的氯化三苯基四氮唑，成為紅色的三苯甲臜(Formazan)。

(2)方法

(i)試劑

 貯存液：用無菌蒸餾水配制Na2HPO4飽和液，取氯化三苯基四氮唑(TTC)775mg，溶于100mlNa2HPO4飽和液中混勻后，放置于暗處，可保存2～3個(gè)月。

 應(yīng)用液：取貯存液4ml，加Na2HPO4飽和液至100ml，混勻后，置暗處，可用2～4周。 

(ii)操作：①以無菌吸管吸取清潔中段尿2ml置于無菌試管中。②加TTC試劑應(yīng)用液0.5ml。③混勻后，置37℃,8h培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果

出現(xiàn)紅色者為陽性，淡紅色者為弱陽性，不變色者為陰性。

(1)原理

 某些細(xì)菌產(chǎn)生卵磷脂酶，即α-毒素，在有鈣離子存在時(shí)，能迅速分解卵磷脂，生成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性的磷酰膽堿。

(2)方法

 培養(yǎng)基：卵黃瓊脂培養(yǎng)基。

 操作：將待檢菌劃線接種于卵黃瓊脂平皿上，于35℃培養(yǎng)3～6h。

(3)結(jié)果

 產(chǎn)生卵磷脂酶的細(xì)菌，培養(yǎng)3h后，在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，6h后擴(kuò)散至5～6mm。

(1)原理

 磷酸酶是一種單膦酸酯的水解酶，可使單磷酸酯水解，其反應(yīng)可根據(jù)反應(yīng)基質(zhì)的不同而異，如用磷酸酚酞為基質(zhì)，經(jīng)磷酸酶水解后可釋放出酚酞，在堿性環(huán)境中可呈紅色。

(2)方法

 培養(yǎng)基：于1000ml溶化的適宜瓊脂培養(yǎng)基并冷至45℃時(shí)，加入過濾除菌的1％磷酸酚酞溶液lml，搖勻后傾注平板。

 操作：取被檢菌的純培養(yǎng)物接種上述平板，于35℃培養(yǎng)18～24h，于平板蓋內(nèi)加l滴濃氨水，熏蒸片刻。

(3)結(jié)果

如有酚酞釋出，菌落即變?yōu)榉奂t色

(1)原理

 DNA酶可將脫氧核糖核酸(DNA)長(zhǎng)鏈水解成由幾個(gè)單核苷酸組成的寡核苷酸鏈。

 長(zhǎng)鏈DNA可被酸沉淀，水解后產(chǎn)生的寡核苷酸則可溶于酸，在DNA瓊脂平皿上加入鹽酸后，在菌落周圍形成透明環(huán)。

(2) 方法

 培養(yǎng)基：DNA酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。

 操作：點(diǎn)狀接種待檢菌于DNA瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)18～24h，用l mol/L鹽酸傾注平皿，觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果

 菌落周圍產(chǎn)生透明環(huán)為陽性，無透明環(huán)為陰性。

(1)原理

 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著于細(xì)菌的表面，產(chǎn)生凝固。

 凝固酶可分為兩種，一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，可用玻片法測(cè)定；另一種是菌體生成后釋放于培養(yǎng)基中的游離凝固酶，可用試管法測(cè)出。

(2)方法

(i)玻片法：在玻片上分別滴加新鮮人或兔血漿及生理鹽水各一滴，挑取待檢菌的菌落，

分別與血漿和生理鹽水混合，立即觀察結(jié)果，如血漿中有明顯顆粒出現(xiàn)，而生理鹽水中無自凝現(xiàn)象為陽性。

(ii)試管法：小試管3支內(nèi)各加入l︰4稀釋的新鮮人或兔血漿0.5ml，①其中一支加待檢菌18～24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml，②另一支加陽性菌株18～24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml，③再一支加肉湯培養(yǎng)基0.5ml為陰性對(duì)照，輕振混勻。3支試管放37℃水浴中3～4h，觀察結(jié)果。

(3)結(jié)果

 待檢菌株管和陽性菌株管出現(xiàn)凝固，陰性對(duì)照管不出現(xiàn)凝固，為陰性。