DNA序列測(cè)定分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序，手工測(cè)序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。美國(guó)PE ABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測(cè)序儀，其中310型是臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中使用最多的一種型號(hào)。本實(shí)驗(yàn)介紹的是ABI PRISM 310型DNA測(cè)序儀的測(cè)序原理和操作規(guī)程。
【原理】
ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測(cè)序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測(cè)序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測(cè)序的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測(cè)器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測(cè)器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測(cè)序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺(tái)能自動(dòng)灌膠、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析等全自動(dòng)電腦控制的測(cè)定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測(cè)序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆?？讖骄?，避免了配膠條件不一致對(duì)測(cè)序精度的影響。它主要由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運(yùn)行等軟件。它使用最新的CCD攝影機(jī)檢測(cè)器，使DNA測(cè)序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由于該儀器具有DNA測(cè)序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DNA測(cè)序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長(zhǎng)片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測(cè)序外，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測(cè)、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
【試劑與器材】
1．BigDye測(cè)序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內(nèi)含PE專利四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應(yīng)緩沖液等。
2．pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對(duì)照模板 0.2g/L，試劑盒配套試劑。
3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4．DNA測(cè)序模板 可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1μl為宜。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/μl。
5．引物 需根據(jù)所要測(cè)定的DNA片段設(shè)計(jì)正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6．滅菌去離子水或三蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離，PE公司產(chǎn)品。
8．3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8g NaAc•3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。
9．70%乙醇和無水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11．POP 6測(cè)序膠 ABI產(chǎn)品。
12．模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品。
13．10×電泳緩沖液 ABI產(chǎn)品。
14．ABI PRISM 310型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀。
15．2400型或9600型PCR儀。
16．臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)。
17．臺(tái)式高速離心機(jī)或袖珍離心機(jī)。
【操作步驟】
1．PCR測(cè)序反應(yīng)
(1) 取0.2ml的PCR管，用記號(hào)筆編號(hào)，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測(cè)定模板管 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待測(cè)的質(zhì)粒DNA 1μl －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1μl
待測(cè)DNA的正向引物 1μl －
M13(-21)引物 － 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
總反應(yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
(2) 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。98℃變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。
2．醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物
(1) 將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12 000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3．電泳前測(cè)序PCR產(chǎn)物的處理。
(1) 加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。
(2) 將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。
(3) 在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95℃ 2min)，冰中驟冷，待上機(jī)。
4．上機(jī)操作 按儀器操作說明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和建立運(yùn)行的測(cè)序順序文件。儀器將自動(dòng)灌膠至毛細(xì)管，1.2kV預(yù)電泳5min，按編程次序自動(dòng)進(jìn)樣，再預(yù)電泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下電泳2h。電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)清洗，灌膠，進(jìn)下一樣品，預(yù)電泳和電泳。每一個(gè)樣品電泳總時(shí)間為2.5h。電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)分析或打印出彩色測(cè)序圖譜。
5．儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測(cè)序序列已知，可通過序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。
6．測(cè)序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)。
【計(jì)算】
測(cè)序反應(yīng)精確度計(jì)算公式：100%－差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650×100%差異堿基即測(cè)定的DNA序列與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。
【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】
1．ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護(hù)。
2．本實(shí)驗(yàn)測(cè)序PCR反應(yīng)的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結(jié)束后PCR液小于4～4.5μl，則此PCR反應(yīng)可能失敗，不必進(jìn)行純化和上樣。
3．作為測(cè)序用戶來說，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個(gè)測(cè)序PCR反應(yīng)使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測(cè)序所需模板的量較少，一般PCR產(chǎn)物需30～90ng，單鏈DNA需50～100ng，雙鏈DNA需200～500ng，DNA的純度一般是A260nm/A280nm為1.6～2.0，最好用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
4．本實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)序試劑盒是BigDye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測(cè)序試劑盒，一般可測(cè)DNA長(zhǎng)度為650bp左右。本儀器DNA測(cè)序精確度為(98.5±0.5) %，儀器不能辨讀的堿基N＜2%，所需測(cè)定的長(zhǎng)度超過了650bp，則需設(shè)計(jì)另外的引物。為保證測(cè)序更為準(zhǔn)確，可設(shè)計(jì)反向引物對(duì)同一模板進(jìn)行測(cè)序，相互印證。對(duì)于N堿基可進(jìn)行人工核對(duì)，有時(shí)可以辨讀出來。為提高測(cè)序的精確度，根據(jù)星號(hào)提示位置，可人工分析該處彩色圖譜，對(duì)該處堿基作進(jìn)一步核對(duì)。
