【試劑盒組成】
25 管 擴(kuò)增反應(yīng)試劑球 (Reagent Sphere; 4℃ 保存)
2 x 520 μl AIV 擴(kuò)增反應(yīng)試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20℃ 保存)
2 x 25 μl 陽(yáng)性對(duì)照 (Positive control; -20℃ 保存)
【保存條件】
試劑球需置干燥劑中保存在4℃，已融解的試劑球則需保存在零下20℃。其他試劑亦需保存在零下20℃。使用前在冰上溶解各試劑并充分混合，不要旋渦振蕩含酶的擴(kuò)增反應(yīng)試劑。
【操作程序】
1 樣本采集、存放及運(yùn)輸
1.1 樣本采集：
所用取樣器材必須經(jīng)高壓或干熱滅菌。
若樣品為活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子時(shí)將拭子深入喉頭口及上顎裂來(lái)回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時(shí)將拭子深入瀉殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2ml PBS（含抗菌素）的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用。
若樣品為新鮮肌肉或臟器，取待檢樣品2g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加10ml PBS混勻，取上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用。為使樣品的代表性更強(qiáng)，也可取50克肉樣，加入50ml無(wú)菌的PBS液，用Bagmixer均質(zhì)器處理后，取上清備用。
若樣品為血清、血漿或冷凍組織滲出液，則直接取用。
1.2 存放：
分離后的樣本在2℃—8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24hr； -70℃以下可長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（最多凍融3次）。
1.3 運(yùn)輸：
采用冰壺或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
2 樣本處理：
2.1 取n個(gè)1.5ml滅菌離心管（n = 樣本數(shù)+ 1管陰性對(duì)照+ 1管陽(yáng)性對(duì)照），作好標(biāo)記。
2.2 首先加入600ul裂解液（裂解液即提取液，有很強(qiáng)的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量清水沖洗并擦干），然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200ul（一份樣本換用一個(gè)吸頭）；再加入200ul氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec（不宜過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻）。
2.3 于12,000g離心15min（如有條件，于4℃進(jìn)行離心）。
2.4 取與步驟2.1.1中相同數(shù)量的1.5ml滅菌離心管，加入400ul異丙醇（－20℃預(yù)冷），作好標(biāo)記。吸取步驟2.1.3各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中（上清液應(yīng)至少吸取500ul，注意不要吸出中間層，該層富含DNA和蛋白質(zhì)），顛倒混勻。
2.5 12,000g離心15min，（注意固定離心管方向，即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體（不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干）；加入600ul 75%乙醇（－20℃預(yù)冷），顛倒洗滌。
2.6 12,000g離心10min，（注意固定離心管方向，即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干）。
2.7 4,000g離心10sec（注意固定離心管方向，即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干（一份樣本換用一個(gè)吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面），室溫干燥5-10min（不宜過(guò)于干燥，以免RNA不溶）。
2.8 加入11ul DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2,000g離心5sec，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁猓捍藭r(shí)的RNA最易受RNA酶降解，請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增）。
3 擴(kuò)增反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備：
3.1 計(jì)算所需的反應(yīng)數(shù)量 (n)
3.2 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n
3.3 每個(gè)試劑球需要 40 μl 試劑球溶液
3.4 在冰上溶解試劑，并輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑)
4 反應(yīng)的準(zhǔn)備
4.1 實(shí)驗(yàn)中除從樣本中獲得的RNA 模板外，我們還建議設(shè)置陽(yáng)性和陰性（水）對(duì)照
4.2 按照下表準(zhǔn)備擴(kuò)增反應(yīng)試劑：
反應(yīng)組分--每個(gè)反應(yīng)體積
擴(kuò)增反應(yīng)試劑 20 μl
樣品RNA 5 μl
總體積 25 μl
注意:實(shí)驗(yàn)時(shí) RNA 應(yīng)放在冰上，陽(yáng)性對(duì)照建議加5 μl 試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照。建議PCR 過(guò)程中檢測(cè)樣本設(shè)置重復(fù)，以便得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了驗(yàn)證陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是由于樣本中存有PCR 抑制物而導(dǎo)致PCR 呈陰性反應(yīng)，我們建議在測(cè)試樣本中加1 μl 的陽(yáng)性對(duì)照作為spiking 對(duì)照(spiking control)，同時(shí)進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
PCR 循環(huán):
1 個(gè)循環(huán) 42℃ 30 分鐘
95℃ 10 分鐘
40 個(gè)循環(huán) 95℃ 30 秒
53℃ 30 秒
72℃ 30 秒
5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析
PCR 的產(chǎn)物需要通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
產(chǎn)物長(zhǎng)度 : 246 bp
Spiking 對(duì)照陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有幾個(gè)可能性： 樣本中不存在目的片段；樣本中目的片段的量低于檢測(cè)值；
【樣本中存有 PCR 抑制物】
試劑盒中設(shè)計(jì)spiking 對(duì)照 (spiking control) 是為了確定沒(méi)有發(fā)生PCR 抑制。如果樣本中加了陽(yáng)性對(duì)照以后得出陰性結(jié)果，說(shuō)明樣本中存在PCR 抑制物，那幺此次陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不能作為正確的結(jié)果，需要重新開始樣本核酸的提取和PCR 擴(kuò)增。
備注：
對(duì)于禽流感檢測(cè)樣本的獲得和前處理，可以參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“高致病性禽流感診斷技術(shù)（GB/T 18936-2003）”推薦的方法進(jìn)行，具體為：
【病料的采集】死禽采集氣管、脾、肺、肝、腎和腦等組織樣品，進(jìn)行分別處理或者同時(shí)處理；活禽病料應(yīng)包括氣管或泄殖腔拭子，尤其以采集氣管拭子更好；小珍禽用拭子取樣易造成損傷，可采集新鮮新鮮糞便。
【病料的保存】病料應(yīng)放在含有抗菌素的pH值7.0～7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS）內(nèi)（無(wú)PBS可用25％～50％的甘油鹽水）?？股氐倪x擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拭子懸液中應(yīng)含有青霉素（2000IU/ml）、鏈霉素（2mg/ml）、慶大霉素（50µg/ml）和制霉菌素（1000IU/ml），但糞便和泄殖腔拭子所有的抗生素濃度應(yīng)提高5倍，加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0～7.4。在室溫放置1h～2h后樣品應(yīng)盡快處理，沒(méi)有條件的可在4℃存放幾天，也可于低溫條件下保存（-70℃貯存最好）。
【病料的處理】將棉拭子充分捻動(dòng)、擰干后棄去拭子；糞便、研碎的組織用含抗生素的pH值7.0～7.4的等滲PBS溶液配成10％～20％（g/ml）的懸液，樣品液經(jīng)1000r/min離心10min，取上清液作為實(shí)驗(yàn)材料。
【病料保存樣本保存和運(yùn)送的一般原則是什么】
一般性原則：采集和運(yùn)輸：
標(biāo)本采集用材料，如棉簽和拭子都應(yīng)一次性使用，所使用的抗腐劑和抗凝劑不應(yīng)對(duì)樣本和擴(kuò)增反應(yīng)有降解或抑制作用。
對(duì)于RNA樣本，要特別注意混入操作人員的毛發(fā)、表皮細(xì)胞和痰液。
對(duì)于DNA樣本的運(yùn)送：可在室溫下運(yùn)送，建議在8小時(shí)內(nèi)完成，對(duì)RNA，10分鐘內(nèi)的運(yùn)輸可在室溫進(jìn)行，超過(guò)此時(shí)間，必須加冰運(yùn)輸，既便低溫，一般亦不得超過(guò)4小時(shí)。
標(biāo)本的保存：對(duì)DNA：2℃－8℃可穩(wěn)定放置3天，RNA一律－20℃保存。
主要的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物質(zhì)：血樣中用于抗凝的肝素，可以枸櫞酸鈉或EDTA-K3替代；血紅蛋白、乳鐵蛋白
【口腔棉簽拭子和瀉殖腔樣品如何保存】
口腔棉簽拭子和瀉殖腔樣本一般不單獨(dú)保存，在取樣后，應(yīng)盡快將其放入含PBS緩沖液（有時(shí)要加入抗生素）的離心管充分捻動(dòng)，擰干后立即進(jìn)行處理和使用，不立即使用時(shí)，推薦-70℃低溫保存。如果暫時(shí)不處理，也可將拭子留于離心管中低溫保存。
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