1 流式細胞儀的概念及其發(fā)展歷史
1.1 流式細胞儀的基本概念
流式細胞儀（flow cytonletry，F(xiàn)CM）是對高速直線流動的細胞或生物微粒進行快速定量測定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術(shù)、細胞的計數(shù)和分選技術(shù)，計算機對數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。流式細胞儀以流式細胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、分子免疫學(xué)、細胞熒光化學(xué)和計算機等學(xué)科知識綜合運用的結(jié)晶。流式細胞術(shù)是一種自動分析和分選細胞或亞細胞的技術(shù)。其特點是：測量速度快、被測群體大、可進行多參數(shù)測量，即對同一個細胞做有關(guān)物理、生物化學(xué)特性的多參數(shù)測量，且在統(tǒng)計學(xué)上有效。
1.2 流式細胞儀的發(fā)展簡史
最早的流式細胞儀雛形誕生于1934年，Moldavan提出使懸浮的單個血紅細胞流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數(shù)，并用光電記錄裝置測量的設(shè)想。1953年Crosland-Taylor根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律設(shè)計了流動室。其后又經(jīng)過Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不斷改進，設(shè)計了光電檢測設(shè)備和細胞分選裝置、完成了計算機與流式細胞儀的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析、開創(chuàng)了細胞的免疫熒光染色及檢測技術(shù)、推廣流式細胞儀在臨床上的應(yīng)用。近20年來，隨著流式細胞儀及其檢測技術(shù)的日臻完善，人們越來越致力于樣品制備、細胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作，以擴大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。
2 流式細胞儀的工作原理和技術(shù)指標(biāo)
2.1 流式細胞儀工作原理
除電源外，流式細胞儀主要由四部分組成：流動室和液流系統(tǒng)：激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)，其中流動室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸?shù)娜蝿?wù)。
2.1.1 信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸
在壓力作用下，鞘液管中的鞘液被持續(xù)不斷地壓入流動室，形成一股穩(wěn)定地連續(xù)的液流，保證了樣本液穩(wěn)定地處于鞘液液流的軸線上，并以單個細胞形式直線通過激光照射區(qū)。激光照射區(qū)又稱測量區(qū)，是指液流與激光束垂直相交的點。當(dāng)細胞攜帶熒光素標(biāo)記物通過激光照射區(qū)時，產(chǎn)生代表細胞內(nèi)部不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360°立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號。散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù)，因此被稱為細胞的物理參數(shù)或固有參數(shù)。散射光又包括前向角散射和測向角散射。前向角散射與被測細胞直徑的平方密切相關(guān)，測向角散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可提供有關(guān)細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。熒光信號也有二種；一種是細胞自身在激光照射下發(fā)出的微弱熒光信號，另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記后的細胞受激發(fā)照射后得到的熒光信號。在免疫分析中常要同時探測兩種以上波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。
經(jīng)熒光染色的細胞受到適合的光激發(fā)后產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。最常用的光電轉(zhuǎn)換器是光電倍增管（PMT）。從PMT輸出的電信號需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞儀中一般備有兩類放大器。一類是線性放大器，其輸出信號與輸入信號成線性關(guān)系。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號，如DNA測量等。另一類是對數(shù)放大器，其輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。放大后的電信號被傳送到計算機，再經(jīng)模一數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存在計算機上。保存在計算機上的數(shù)據(jù)可在脫機后再進行數(shù)據(jù)處理和分析。
2.1.2 流式細胞儀分選原理
并不是所有的流式細胞儀都具有分選功能。流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的。由噴嘴射出的液流柱在電信號作用下發(fā)生振動，斷裂形成均勻的小液滴。根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間。精確測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，可根據(jù)具體要求進行適當(dāng)調(diào)整。
2.1.3 數(shù)據(jù)的顯示和分析
數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析。單參數(shù)直方圖是使用最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。單參數(shù)直方圖是由X、Y二方向組成的二維平面圖。橫座標(biāo)X是所測的熒光或散射光的強度，用“道數(shù)”（Channel No．）來表示。選擇的放大器類型不同，標(biāo)度不同?？v座標(biāo)Y通常表示被測細胞的絕對數(shù)目。正常情況下，數(shù)據(jù)分析得到的圖形為具有一個或若干個峰的曲線圖。對曲線圖的解釋應(yīng)該具體問題具體分析。
除直方圖外，數(shù)據(jù)顯示方式還包括二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點圖也是比較常用的數(shù)據(jù)顯示類型。它顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系，也是二維平面圖，橫縱坐標(biāo)可以根據(jù)自己選定的被測參數(shù)自行決定，點的位置表明了細胞和顆粒具有的二個被測參數(shù)的數(shù)值。二維點圖所提供的信息量要大于單參數(shù)直方圖。
數(shù)據(jù)分析的方法大體可分為參數(shù)法和非參數(shù)法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型時則多使用參數(shù)方法。非參數(shù)分析法不用對顯示的圖像做任何假設(shè)，也不采用數(shù)學(xué)模型，分析程序可以很簡單，也可能很復(fù)雜。臨床醫(yī)學(xué)較常使用非參數(shù)分析法。
2.2 流式細胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)
流式細胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異系數(shù)（CV值）來表示?，F(xiàn)在市場上主流型號出廠時的熒光分辨率應(yīng)該小于2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力。一般用熒光微球上可測出的FITC的最少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達到1000左右。儀器工作時樣品濃度一般在105～107細胞/ml。分析速度/分選速度是指流式細胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數(shù)目。一般分析速度為5000～10000，分選速度控制在1000以下。
流式細胞儀測量的數(shù)據(jù)是相對值，因此需要在使用前對系統(tǒng)進行校準(zhǔn)或標(biāo)定。流式細胞儀的校準(zhǔn)有二個目的，即儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。通常使用標(biāo)準(zhǔn)微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。
1.1 流式細胞儀的基本概念
流式細胞儀（flow cytonletry，F(xiàn)CM）是對高速直線流動的細胞或生物微粒進行快速定量測定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術(shù)、細胞的計數(shù)和分選技術(shù)，計算機對數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。流式細胞儀以流式細胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、分子免疫學(xué)、細胞熒光化學(xué)和計算機等學(xué)科知識綜合運用的結(jié)晶。流式細胞術(shù)是一種自動分析和分選細胞或亞細胞的技術(shù)。其特點是：測量速度快、被測群體大、可進行多參數(shù)測量，即對同一個細胞做有關(guān)物理、生物化學(xué)特性的多參數(shù)測量，且在統(tǒng)計學(xué)上有效。
1.2 流式細胞儀的發(fā)展簡史
最早的流式細胞儀雛形誕生于1934年，Moldavan提出使懸浮的單個血紅細胞流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數(shù)，并用光電記錄裝置測量的設(shè)想。1953年Crosland-Taylor根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律設(shè)計了流動室。其后又經(jīng)過Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不斷改進，設(shè)計了光電檢測設(shè)備和細胞分選裝置、完成了計算機與流式細胞儀的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析、開創(chuàng)了細胞的免疫熒光染色及檢測技術(shù)、推廣流式細胞儀在臨床上的應(yīng)用。近20年來，隨著流式細胞儀及其檢測技術(shù)的日臻完善，人們越來越致力于樣品制備、細胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作，以擴大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。
2 流式細胞儀的工作原理和技術(shù)指標(biāo)
2.1 流式細胞儀工作原理
除電源外，流式細胞儀主要由四部分組成：流動室和液流系統(tǒng)：激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)，其中流動室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸?shù)娜蝿?wù)。
2.1.1 信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸
在壓力作用下，鞘液管中的鞘液被持續(xù)不斷地壓入流動室，形成一股穩(wěn)定地連續(xù)的液流，保證了樣本液穩(wěn)定地處于鞘液液流的軸線上，并以單個細胞形式直線通過激光照射區(qū)。激光照射區(qū)又稱測量區(qū)，是指液流與激光束垂直相交的點。當(dāng)細胞攜帶熒光素標(biāo)記物通過激光照射區(qū)時，產(chǎn)生代表細胞內(nèi)部不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360°立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號。散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù)，因此被稱為細胞的物理參數(shù)或固有參數(shù)。散射光又包括前向角散射和測向角散射。前向角散射與被測細胞直徑的平方密切相關(guān)，測向角散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可提供有關(guān)細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。熒光信號也有二種；一種是細胞自身在激光照射下發(fā)出的微弱熒光信號，另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記后的細胞受激發(fā)照射后得到的熒光信號。在免疫分析中常要同時探測兩種以上波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。
經(jīng)熒光染色的細胞受到適合的光激發(fā)后產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。最常用的光電轉(zhuǎn)換器是光電倍增管（PMT）。從PMT輸出的電信號需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞儀中一般備有兩類放大器。一類是線性放大器，其輸出信號與輸入信號成線性關(guān)系。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號，如DNA測量等。另一類是對數(shù)放大器，其輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。放大后的電信號被傳送到計算機，再經(jīng)模一數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存在計算機上。保存在計算機上的數(shù)據(jù)可在脫機后再進行數(shù)據(jù)處理和分析。
2.1.2 流式細胞儀分選原理
并不是所有的流式細胞儀都具有分選功能。流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的。由噴嘴射出的液流柱在電信號作用下發(fā)生振動，斷裂形成均勻的小液滴。根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間。精確測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，可根據(jù)具體要求進行適當(dāng)調(diào)整。
2.1.3 數(shù)據(jù)的顯示和分析
數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析。單參數(shù)直方圖是使用最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。單參數(shù)直方圖是由X、Y二方向組成的二維平面圖。橫座標(biāo)X是所測的熒光或散射光的強度，用“道數(shù)”（Channel No．）來表示。選擇的放大器類型不同，標(biāo)度不同?？v座標(biāo)Y通常表示被測細胞的絕對數(shù)目。正常情況下，數(shù)據(jù)分析得到的圖形為具有一個或若干個峰的曲線圖。對曲線圖的解釋應(yīng)該具體問題具體分析。
除直方圖外，數(shù)據(jù)顯示方式還包括二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點圖也是比較常用的數(shù)據(jù)顯示類型。它顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系，也是二維平面圖，橫縱坐標(biāo)可以根據(jù)自己選定的被測參數(shù)自行決定，點的位置表明了細胞和顆粒具有的二個被測參數(shù)的數(shù)值。二維點圖所提供的信息量要大于單參數(shù)直方圖。
數(shù)據(jù)分析的方法大體可分為參數(shù)法和非參數(shù)法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型時則多使用參數(shù)方法。非參數(shù)分析法不用對顯示的圖像做任何假設(shè)，也不采用數(shù)學(xué)模型，分析程序可以很簡單，也可能很復(fù)雜。臨床醫(yī)學(xué)較常使用非參數(shù)分析法。
2.2 流式細胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)
流式細胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異系數(shù)（CV值）來表示?，F(xiàn)在市場上主流型號出廠時的熒光分辨率應(yīng)該小于2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力。一般用熒光微球上可測出的FITC的最少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達到1000左右。儀器工作時樣品濃度一般在105～107細胞/ml。分析速度/分選速度是指流式細胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數(shù)目。一般分析速度為5000～10000，分選速度控制在1000以下。
流式細胞儀測量的數(shù)據(jù)是相對值，因此需要在使用前對系統(tǒng)進行校準(zhǔn)或標(biāo)定。流式細胞儀的校準(zhǔn)有二個目的，即儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。通常使用標(biāo)準(zhǔn)微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。
