在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時(shí)間縮短，而堿性化合物延長(zhǎng)；
緩沖液可以緩沖溶液pH的改變，緩沖液的定義是加入少量的酸或堿時(shí)能緩沖pH，就是說(shuō)添加酸或堿時(shí)pH的變化很小。這個(gè)保持pH的能力就叫做緩沖能力，它是由緩沖液的濃度和緩沖鹽的pKa決定的，緩沖鹽在pKa附近的緩沖能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩沖鹽的pKa。注意這是在水中測(cè)的，沒(méi)有加有機(jī)溶劑。當(dāng)加入有機(jī)溶劑時(shí)，pKa會(huì)有所變化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都會(huì)有一樣的變化。
對(duì)于液相常用濃度來(lái)說(shuō)，緩沖液應(yīng)維持在緩沖鹽的pKa的1.5個(gè)pH單位左右，當(dāng)濃度特別稀的時(shí)候，如低于5mM，就要把范圍縮小，大概+/-1個(gè)pH單位。
表1：常用緩沖鹽的pKa值（25℃）
緩沖鹽 | pKa |
醋酸鹽 | 4.75 |
銨鹽 | 9.24 |
硼酸鹽1 | 9.24 |
硼酸鹽2 | 12.74 |
硼酸鹽3 | 13.80 |
檸檬酸鹽1 | 3.13 |
檸檬酸鹽2 | 4.76 |
檸檬酸鹽3 | 6.40 |
2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES) | 6.15 |
草酸鹽1 | 1.27 |
草酸鹽2 | 4.27 |
磷酸鹽1 | 2.15 |
磷酸鹽2 | 7.20 |
磷酸鹽3 | 12.38 |
三氯乙酸 | 0.52 |
三乙醇胺 | 7.76 |
三乙胺 | 10.72 |
三氟乙酸 | 0.50 |
三羥甲基氨基甲烷(Tris) | 8.08 |
建議在開(kāi)發(fā)方法的時(shí)候首先要選擇緩沖鹽和 pH范圍，然后用溶液的選擇性微調(diào)分離。這個(gè)策略快速而高效，而且可以讓你避免陷入緩沖液pH的泥潭。
1）建議溫度設(shè)置在25℃-40℃，適當(dāng)?shù)闹鶞乇３至己玫谋Ａ魰r(shí)間的重現(xiàn)性，一定程度上提高柱效，增加分離度。
2）柱溫過(guò)低，流動(dòng)相的粘度下降，色譜柱的背壓降低。
3）柱溫太高，與檢測(cè)器之間溫差太大，使峰變形，加快離子對(duì)試劑或緩沖鹽對(duì)硅膠基質(zhì)的攻擊，硅膠溶解，縮短色譜柱的壽命；柱溫太低，使得需要制冷的柱溫箱，硬件要求太高，不利于方法的推廣。
4）溫度的改變會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，如果儀器自動(dòng)進(jìn)樣過(guò)夜或過(guò)周末，就會(huì)發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間隨著實(shí)驗(yàn)室溫度的改變而產(chǎn)生漂移，顯然這種問(wèn)題用柱溫箱就可以避免。
