1 選用
C18的選用主要考慮2個問題，即柱填料和柱規(guī)格對色譜柱的影響。
1.1 C18柱的填料對色譜柱的影響
柱填料的物理性能對填料色譜行為有重要影響。填料主要的物理性能包括如下：顆粒度、孔徑、孔體積、鍵合相化學、含碳量及烷基化處理。
(1)顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小。實際上色譜柱上所標的粒徑是一個平均值。如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm，實際上有一個顆粒分布度。這種分布度對柱反壓及柱效有重要作用。一般來說，平均顆粒度越小，顆粒分布度越小，色譜柱效越高，反壓亦越高。目前C18柱填料粒徑在4～10μm之間。
(2) 孔徑是指填料顆粒間的孔間隙。一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑。球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結構均勻，柱效高，重現(xiàn)性好；無定形填料平均孔徑分布較寬，柱床結構不均勻，流動相線性速度不均勻，譜帶擴寬。平均孔徑的大小對分離大分子化合物有較大的影響，在分離含有較大分子的樣品時可能會有分子排阻效應，或產(chǎn)生吸附效應從而影響定量的回收率及準確度。因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時應考慮選用大孔徑(如30nm)的反相柱填料。孔體積作為硅膠多孔性的參數(shù)，在分離分析較大分子化合物時可作參考，選用較大孔體積的反相柱填料。
(3)化學鍵合相填料在高效液相色譜法中占有極重要的地位。它可以鍵合極性較大的有機基團，采用極性較小的溶劑作流動相。亦可鍵合極性較小的有機基團，選用極性較大的溶劑作流動相。C18色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的，這類鍵合反應目前應用最為普遍。如以十八烷基三氯硅烷與全多孔型硅膠M-Porasil-C18反應生成烷基化學鍵合相，商品名為M-Bondapak-C18
(4)碳含量即填料中的含碳量。傳統(tǒng)的測量技術是將填料加熱到碳氫鍵斷裂，然后通過測定損失的重量或形成的二氧化碳來計算碳含量?？梢酝ㄟ^增加碳鍵的長度或增加鍵合密度來增加碳含量。碳含量增加，柱子的保留值增加。鍵合相的色譜行為與鍵合密度有關，也與硅膠的密度及填料的表面積有關，填料的密度越高，填柱所需的硅膠量越多，柱子的含碳量也越高。如果用2種不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行為將明顯不同。因此，單獨以碳含量來預測色譜行為是不夠的。
(5)C18硅烷化試劑是一個大于2nm大分子，因此會與已鍵合在相鄰的硅醇基上的C18硅烷化試劑產(chǎn)生嚴重的立體位阻。其結果導致在硅膠表面有大量的殘留硅醇基沒有與硅烷化試劑反應，這些極性的硅醇基在一定色譜條件下會與堿性化合物相互作用引起峰形拖尾，從而可影響定量分析結果。這些問題在一定程度上可以通過烷基化處理加以克服。烷基化處理是在鍵合相上完成的獨立反應，以減少在硅膠表面的硅醇基。烷基化處理采用小分子(如三甲硅烷)的試劑，其空間位阻遠小于C18基團。大多數(shù)固定相僅有30%可覆蓋的鍵合位置。據(jù)報道，通過某些極活躍的化學試劑及特殊的反應條件，最高的覆蓋量可達50%。很好地了解硅膠鍵合相的物理特性將有助于在高效液相色譜的反應中選擇合適的色譜柱。表面上看C18柱雖然化學官能團相同，而實際上不同品牌的C18柱性能可能有很大差別，從而產(chǎn)生不同的分離結果。
1.2 C18柱的規(guī)格對色譜柱的影響
柱填料的選擇關系到色譜分離的可能性，而柱規(guī)格的選擇直接影響分析速度、分離能力、檢測能力及每次分析的溶劑消耗等。柱規(guī)格包括兩方面：柱內(nèi)徑和柱長度。柱內(nèi)徑，分析型一般為2～6mm,制備型20mm，大者可達80mm；柱長度，分析型5～30cm，制備型15～50cm。一般來說，柱內(nèi)徑不影響分離度與分析時間的關系。今天，柱技術已發(fā)展到不同柱內(nèi)徑的柱子能夠具有相同的性能。不同內(nèi)徑的柱子又各具特點，對相同的分析時間和分離度來說，內(nèi)徑大的柱子比內(nèi)徑小的柱子多消耗溶劑。另一方面，較小內(nèi)徑的柱子對相同的檢測信號來說所需樣品量亦較少。因此，在樣品量有限時，可使用小內(nèi)徑柱。柱長度增加雖可改善分離效果，但阻力也隨之增加，必須提高入口壓力。柱壓是同時影響增加分離度和減少分析時間的主要障礙。分離度、分析時間及柱壓三者相互制約，選擇好其中兩者，則第3個因素也就選好了。長柱可以給出高分離度，短柱可提供快速分離，我們可以根據(jù)樣品情況去選用合適的色譜柱
1.3 C18柱選用的基本原則
(1)選用經(jīng)過烷基化處理封口的填料可防止堿性化合物的拖尾現(xiàn)象。
(2)選用含碳量高的柱子，增加保留值。
(3)選用較短的柱子(如15cm，7.5cm)。
(4)選用小顆粒度的填料。
(5)對分子量大的組分選用大孔徑填料的柱子。
日常使用和維護
在日常分離分析工作中，色譜柱使用是否得當，直接影響色譜柱的壽命。下面介紹C18柱在日常使用過程中應注意的事項。
(1)柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。
(2)如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置1根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
(3)如使用柱溫控制裝置時，應注意在通入流動相后才能升溫。
(4)流動相使用前需進行脫氣處理，以免降低柱效和影響檢測等。樣品溶液需經(jīng)適當?shù)那疤幚砑斑^濾，以減少柱污染和堵塞。
(5)在更換流動相種類時，應注意溶劑的互溶性，防止發(fā)生鹽析現(xiàn)象。
(6)柱子的實際操作壓力應低于填裝時的最高壓力，最好在最高壓力一半以下。一般不超過20593.965～29419.95 kPa。在低壓力(≤14 709.975kPa)的范圍使用，可使柱保持長時期的高柱效。
(7)C18色譜柱屬非極性鍵合相色譜柱，流動相的pH值應嚴格控制在2～7之間，以免損壞柱子。
(8)在完成分離分析工作之后，不應立即停機，需及時對色譜分析系統(tǒng)進行沖洗，一般0.5 h以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
(9)如果流動相中有鹽類，首先用水充分清洗。如果是胺類(如三甲胺類或四丁基胺類)添加到流動相中，要用50%甲醇和0.05%磷酸溶液混合溶劑沖洗，不要只用水沖洗。
(10)C18一般用100%甲醇作為保存溶劑，以防柱子干裂而損壞。嚴禁水或緩沖溶液長時間在色譜流路中保留。
(11)選用合適的C18保護柱，以保護分析柱免受雜質(zhì)顆粒及不可逆吸附的干擾物的影響。保護柱內(nèi)裝填料顆粒度應與分析柱填料的顆粒度盡量一致。
(12)柱的保存期不宜太長。短期不用的C18柱，用甲醇沖洗30～60min，然后將柱兩端密封。較長期不用的柱子，一是采取定期沖洗，再密封的方法；二是在沖洗后，柱兩端各裝1只有一定容量的灌滿甲醇的容器(只裝一端也可)，以補充在較長存放期間柱內(nèi)溶劑的蒸發(fā)。
3 維修
色譜柱在日常使用過程中，盡管保護嚴格，樣品和流動相盡管經(jīng)過前處理，但經(jīng)過長時間的使用，仍然難以完全避免柱子受到污染，固定相流失、板結、柱床塌陷以及柱效下降等。有些可以通過維修，使部分柱效恢復。
3.1 柱污染再生技術
色譜柱污染后，可以用合適的溶劑沖洗，使柱效再生。C18柱常規(guī)的再生洗滌方法是：分別用甲醇、三氯甲烷、甲醇/水各60mL依次通過色譜柱，再用100%甲醇60mL平衡色譜柱后封存，柱效將恢復正常。必要時，根據(jù)柱污染性質(zhì)(如有機污染、鹽類污染等)，采用0.05 mol/L H2SO4、0.5 mol/L H3PO4或0.1 mol/L EDTA鈉鹽沖洗，然后再用水沖洗，最后用100%甲醇平衡色譜柱后封存。對于嚴重污染的C18柱，可采用水、甲醇、氯仿、乙烷依次沖洗后，按順序倒過來再沖洗1次，每次所用溶劑60mL，不接檢測器，最后用100%甲醇平衡色譜柱封存。
3.2 柱污染的修復
在柱污染再生無效或已知柱污染嚴重時，可以采用柱修補的方法解決，但柱污染深度不宜超過5 mm。方法是將特制小鏟將污染部分挖去，再用與柱填料相同的固定相與流動相混合制成漿狀，然后將漿狀固定相仔細補入被挖去的部分(盡量使后填補的固定相接近原裝的緊密程度)，修平端面即可。修好的柱子如果柱頭兩端的篩板的孔徑是一致的，可將柱子顛倒過來使用一般時間，目的是借助流動相沖洗作用，恢復柱床緊密程度。
3.3 柱塌陷的修復
柱塌陷的原因很多。對于塌陷不太嚴重時，如果柱頭兩端的篩板孔徑是一致的，可將柱顛倒使用一般時間，即可恢復性能。當塌陷嚴重(5mm左右)時，可采用柱污染的修復方法修補即可。
