portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。傳代保存時，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣?！ ?/p>
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進(jìn)行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：
portant; color: rgb(243, 11, 43); font-size: 16px;">①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉;
portant; color: rgb(243, 11, 43); font-size: 16px;">②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異;
portant; color: rgb(243, 11, 43); font-size: 16px;">③反復(fù)傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低;
portant; color: rgb(243, 11, 43); font-size: 16px;">④需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大;
portant; color: rgb(243, 11, 43); font-size: 16px;">⑤雜菌的污染機(jī)會較多。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細(xì)菌等的保存。此法可防止干燥，并通過限制氧的供給而達(dá)到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優(yōu)點，同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌)的保存，而某些細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進(jìn)行保存。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">即將微生物吸附在適當(dāng)載體上進(jìn)行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如：
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風(fēng)干、粉碎、過篩和滅菌。使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是：取適量土壤(5克)，置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜)，然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進(jìn)行大量接種，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認(rèn)的程度為止，移入干燥器中經(jīng)短時間干燥或風(fēng)干后密封，冷藏或室溫保存。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">②砂土保存法：取清潔的砂，篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數(shù)次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經(jīng)干熱滅菌后，加入1mL菌種培養(yǎng)液，經(jīng)充分混勻后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經(jīng)HCl預(yù)處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌，再進(jìn)行菌種保藏。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">③硅膠保存法：portant;">以6～16目的無色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設(shè)法加以冷卻。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">④磁珠保存法：將菌液浸入素?zé)胖?或多孔玻璃珠)后再進(jìn)行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長達(dá)兩年半時間。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">⑤麩皮保存法：在麩皮內(nèi)加入60%的水，經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng)，最后干燥保藏。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">⑥紙片(濾紙)保存法：將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進(jìn)行保存。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">即使微生物混懸于適當(dāng)溶液中進(jìn)行保存的方法。常用的方法有：
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">①蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年。本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā)。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">②糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長達(dá)10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進(jìn)行保存。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言，無論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會對菌體造成損傷，當(dāng)采用這種保藏方法時，應(yīng)注意以下幾點：
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞。
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">② 要選擇適宜的培養(yǎng)基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異。
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長。
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">④ 最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)(如食鹽等)。
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">⑤ 可在菌液內(nèi)添加甘油等保護(hù)劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護(hù)劑時更有效。
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">⑥ 原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理，但當(dāng)加入保護(hù)劑時，可靜置一段時間后再進(jìn)行處理。
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">⑦ 就動物細(xì)胞而言，應(yīng)在-20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在-35℃范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍。
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">⑧ 若進(jìn)行長期保存，則貯藏溫度越低越好。
portant; color: rgb(255, 79, 121); font-size: 16px;">⑨取用冷凍保存的菌種時，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">常用的冷凍保存法包括：
portant;">①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護(hù)劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。
portant; color: rgb(95, 156, 239); font-size: 16px;">②干冰保存法(-70℃左右)：
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存；
portant; color: rgb(95, 156, 239); font-size: 16px;">③液氮保存法(-196℃)：
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">是適用范圍最廣的微生物保存法。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">其操作步驟如下：
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1mL的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">b、熔封安瓶管：portant;">若直接貯存于氣相液氮中(-150℃～-170℃)時，則不需熔封。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后，觀察有無色素進(jìn)入安瓶。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">e、速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實上，從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的生理活動就會停止，因此可以達(dá)到長期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進(jìn)行冷凍干燥時，需注意以下幾個問題：
portant; color: rgb(95, 156, 239);">a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：portant; color: rgba(23, 23, 21, 0.921569);">首先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜;菌齡以達(dá)到對數(shù)生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好;菌液濃度以高為好，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109～1010/mL。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">b、菌株號碼等的標(biāo)記：portant;">可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶內(nèi)封入標(biāo)簽。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">c、安瓶的準(zhǔn)備：portant;">將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標(biāo)簽，干熱滅菌或溫?zé)釡缇螅?0℃恒溫干燥。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">portant;">d、添加保護(hù)劑：portant;">常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法：在5mL菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。
portant; word-wrap: break-word !important; font-size: 16px;">在5ml菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。
