各種細菌所具有的酶系統(tǒng)各不相同，對營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力各異，因而在代謝過程中所產(chǎn)生的合成或分解產(chǎn)物也不同。應(yīng)用生物化學(xué)方法檢測細菌的代謝產(chǎn)物，有助于細菌的種、屬鑒定。這種利用生化方法來鑒別細菌的試驗，統(tǒng)稱為細菌的生化試驗或生化反應(yīng)，是識別細菌的重要方法之一。微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其他方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。
微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)有：
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各種微生物因含有不同的分解糖（醇、苷）類的酶，所以分解糖類的能力各不相同，而且分解相應(yīng)糖類后形成的終末產(chǎn)物亦隨細菌種類而異，有的產(chǎn)酸，有的還可以產(chǎn)生氣體，因此可作為鑒別細菌的依據(jù)，對腸道桿菌的鑒別尤為常見?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。
試驗方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基魯，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36℃ ±1.0 ℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力，培養(yǎng)物可呈彌散生長。
本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫、溴百里藍和An-drade指示劑。
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某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。
試驗方法：以18h~24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區(qū)接種，試驗數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36℃ ±1 ℃培養(yǎng)24 h ~48 h,或于20℃培養(yǎng)5d。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)基表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍色。
淀粉水解系逐步進行的過程，因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7. 2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。
（三） V-P試驗
某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應(yīng)。
1.O'Meara氏法
將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)液1 mL加O'Meara試劑（加油0.3%肌酸或肌酸酐的40%氫氧化鈉水溶液）1mL，搖動試管1min~2min，靜置于室溫或36 ℃ ±1 ℃恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅即判定為陰性。亦有主張在48 ℃-50 ℃水浴放置2h后判定結(jié)果者。
2. Barritt氏法
將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36℃ ±1 ℃培養(yǎng)4 d,取培養(yǎng)液2.5 mL先加入5% α-萘酚純酒精溶液0.6%mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.2mL，搖動2min~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36 ℃ ±1 ℃恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色可判定為陰性。
3.快速法
將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中，挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5% a-萘酚3滴， 40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5 min,判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。
本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽孢桿菌和葡萄球菌等其他細菌時，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基甲醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。本試驗常與甲基紅試驗一起使用。本試驗陽性，甲基紅試驗陰性，反之亦然。
（四） 甲基紅試驗
腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH 下降至4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。
試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36 ℃ ±1 ℃或30℃ （以30℃較好） 3d-5d,從第二天起，每日取培養(yǎng)液1 mL,加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性即可判定結(jié)果。
甲基紅為酸性指示劑， pH范圍為4.4-6.0,其pH為5.0,故在pH5.0以下，隨酸度增加而紅色增強，在pH5.0以上，則隨堿度增加而黃色增強，在pH5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗。
（五）靛基質(zhì)試驗
某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于36℃ ±1 ℃培養(yǎng)24 h后，取約2 mL培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2滴~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性；或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。
實驗證明靛基質(zhì)試劑可與17種不同的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。
?。┫跛猁}還原試驗
有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。
1.試驗方法
臨試前將試劑的A （磺胺酸冰乙酸溶液）和B （a-萘胺乙醇溶液）試液各0.2 mL等量混合，取混合試劑約0.1 mL,加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10 min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。
用a-萘胺進行試驗時，陽性紅色消退很快，故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。a-萘胺具有致癌性，故使用時應(yīng)加注意。
2.試驗方法
將含有0.02%-0.2%硝酸鉀的蛋白胨水分裝至試管中，每支試管預(yù)先放一個倒置的發(fā)酵管，然后在121℃高壓滅菌15 min.按肉湯培養(yǎng)基方法接種，連同已滅菌的對照管一起在最佳生長溫度培養(yǎng)2d-7d,在接種管和對照管中加上Griess Ilosvay試劑1 mL或亞硝酸鹽試紙，幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色表明亞硝酸鹽產(chǎn)生。對照管應(yīng)為微紅色或無色。
陰性結(jié)果應(yīng)進行確證。向試管中加入微量鋅粉，將殘存的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，出現(xiàn)紅色表明有硝酸鹽存在；如沒有顏色變化，則說明沒有硝酸鹽存在，硝酸鹽已被微生物還原成亞硝酸鹽。發(fā)酵管中有氣體產(chǎn)生表明有氮氣生成。
?。ㄆ撸┟髂z液化試驗
有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。
1.營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基
在營養(yǎng)肉湯中加入10% ~15%的明膠，調(diào)節(jié)pH至7.2, 115℃高壓滅菌20 min。
試驗方法：挑取18 h-24 h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養(yǎng)基。于20℃-22 ℃培養(yǎng)7 d~14d,明膠高層亦可培養(yǎng)于36 ℃ ±1 ℃。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時應(yīng)不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后，再觀察其是否被細菌液化，如確被液化，即為試驗陽性。平板試驗結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點種的菌落上滴加試劑，若為陽性， 10 min -20 min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)，否則為
陰性。
2. Frazier明膠瓊脂（改良型）培養(yǎng)基
在營養(yǎng)瓊脂中加入0.4%明膠，調(diào)節(jié)pH至7.2, 115 ℃高壓滅菌20 min。
試驗方法：在已倒好干燥培養(yǎng)基的平皿上劃線接種或點接種。在最佳生長溫度下培養(yǎng)2d-14d。使用8mL~10 mL1%鹽酸（HCI不像氯化汞溶液那樣能很快的產(chǎn)生清晰的沉淀，但本書仍建議使用鹽酸，這是為了避免汞鹽的毒性及對環(huán)境造成的危害）試劑充滿培養(yǎng)皿，沒有水解的明膠與試劑慢慢形成不透明的白色沉淀，水解的明膠部分呈現(xiàn)了一個清晰的環(huán)帶。以毫米為單位記錄從菌落邊緣到環(huán)帶邊緣的清晰帶的大小。
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有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解，產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.00。
試驗方法：挑取18 h-24 h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖勻，于36℃±1℃培養(yǎng)10 min,、60 min和120 min,分別觀察結(jié)果；或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2 h、4h和24 h分別觀察結(jié)果，變?yōu)榉奂t色為陽性，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4d,做最終判定。
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氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這個試驗最適用于假單胞菌屬和其他革蘭氏陰性桿菌的鑒別。
試驗方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1滴~2滴，陽性者Ko-vacs氏試劑呈粉紅色-深紫色， Ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)為判定試驗結(jié)果。
（十）硫化氫試驗
有些細菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。在腸桿菌科的細菌鑒別中有重要作用。
試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36℃ ±1℃培養(yǎng)24 h-28 h,培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6d。也可用乙酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將乙酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會被濺濕為適度，用管塞住置36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)為1d-6d,紙條變黑為陽性。
（十一）三糖鐵（TSI ）瓊脂試驗
試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36℃ ±1 ℃培養(yǎng)18 h-24 h,觀察結(jié)果。
本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃），產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。
注意： TSI瓊脂培養(yǎng)基可以代替Kligler鐵瓊脂檢測硫化氫的產(chǎn)生。但是，檸檬酸桿菌和變形桿菌屬中的一些產(chǎn)硫化氫的菌株，在TSI瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生的硫化氫會被蔗糖發(fā)酵產(chǎn)物所掩蓋，因此，在做這些菌的產(chǎn)硫化氫試驗時， Kligler鐵瓊脂是更為可靠的試驗培養(yǎng)基。
（十二）硫化氫-靛基質(zhì)一動力瓊脂試驗
試驗方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約二分之一深度，置36 ℃ ±1℃培養(yǎng)18h-24 h,觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10 min,若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。
本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。
?。ㄊ幟仕猁}利用試驗
以檸檬酸鈉為唯一碳源、pH 7.0的培養(yǎng)基上，某些細菌能分解檸檬酸鈉產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中指示劑溴麝香草酚藍由淺綠色變?yōu)樯钏{色，此為檸檬酸鹽利用試驗陽性。如不能利用檸檬酸鹽，此試驗為陰性反應(yīng)。將細菌分別接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上，于37℃培養(yǎng)1d-4d,每日觀察結(jié)果。培養(yǎng)基斜面上有細菌生長，而且培養(yǎng)基變成藍色為陽性；無細菌生長，培養(yǎng)基顏色不變保持綠色為陰性。
?。ㄊ模┼徬趸?8-D吡喃半乳糖苷酶測定
乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和B-半乳糖苷酶才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-B-D-半乳糖苷（0-nitophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于檸檬酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。
將0.6 g ONPG溶解于100 mL,磷酸緩沖液內(nèi)，過濾滅菌后，與300 ml.蛋白胨水混合，無菌分裝小試管，于冰箱內(nèi)保存，備用， 1年內(nèi)使用有效。挑取幼齡斜面培養(yǎng)物一環(huán)于上述培養(yǎng)基內(nèi)，適溫培養(yǎng)24 h;制備濃的菌懸液（于0.5 mL生理鹽水的細管）中加ONPG紙片，35 ℃-37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。黃色為陽性，無色為陰性。也可直接將培養(yǎng)物接種ONPG試劑， 35℃-37 ℃培養(yǎng)1 h-3h即可以觀察結(jié)果，如為陰性繼續(xù)培養(yǎng)至24h,培養(yǎng)基變黃則為陽性。
（十五）膽汁-七葉苷水解試驗
在10% ~40%膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細菌分解生成七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵的二價鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。主要用于鑒況D群鏈球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如：脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。D群鏈球菌本試驗為陽性。
將被檢菌接種于膽汁-七葉苷培養(yǎng)基中， 35℃孵育18h~24 h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。
（十六）苯丙氨酸脫氨酶試驗
苯丙氨酸脫氨酶試驗可用于鑒別腸道細菌，例如對大腸桿菌與變形桿菌的鑒別。變形桿菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨，產(chǎn)生苯丙酮酸；而大腸桿菌不具有苯丙酸脫氨酶，不能將苯丙氨酸氧化脫氨，故不能產(chǎn)生苯丙酮酸。
具體操作為：將大腸桿菌和普通變形桿菌分別接種到苯丙氨酸斜面培養(yǎng)基上（注意接種量要大），置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)4h （或18 h-24 h）。觀察結(jié)果時，在培養(yǎng)好的菌種斜面上滴加2滴-3滴10%一氯化鐵溶液，試液自培養(yǎng)物上方流到下方，苯丙酮酸遇三氯化鐵形成綠色化合物，此為陽性反應(yīng)；若培養(yǎng)基不出現(xiàn)顏色變化，則為陰性反應(yīng)。
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此法可同時測定色氨酸脫羧酶、脲酶和吲哚3個項目。
1.方法一
（1）培養(yǎng)基
L-色氫酸 3g； NaCl 5g；
KH2PO4 1g; 乙醇（95% ） 10 mL:
K2 HPO4 1g; 蒸餾水 900 mL
加酚紅（25 mg~30 mg）至微橙的黃色， pH約為6.8~6.9,分裝于三角瓶中， 121 ℃蒸氣滅菌20 min。另將20g尿素溶于100 mL水中，過濾滅菌，用無菌操作與上述熱滅菌的培養(yǎng)基相混，并分裝于無菌試管內(nèi)，每管液層高約3cm ~4 cm。
?。?）接種與測定：將試驗菌株的幼齡培養(yǎng)物接種于上述培養(yǎng)液中，適溫培養(yǎng)24 h,取2滴~4滴培養(yǎng)液，與1滴三氯化鐵溶液（約33% ）相混。如呈紅褐色，則為色氨酸脫氨酶陽性反應(yīng)。如無顏色變化則為陰性反應(yīng)?？捎米冃尉鳛殛栃詫φ?。
?。?）結(jié)果觀察：如培養(yǎng)后的培養(yǎng)液由黃色轉(zhuǎn)紅色，表示有脲酶存在。如用對甲基氨基苯甲醛試劑測定，可檢查有無吲哚形成。如不擬測定脲酶，配制培養(yǎng)基時可不加酚紅和尿素。
2.方法二
?。?）試液
L-色氨酸 0.2% -0.5%
FeCl3 33%
生理鹽水或pH6. 8緩沖液
A液： KH2PO4, 0.2 mol/L （27. 2 g/L） 50 mL
B液： Na2 CO3, 0. 2 mol/L （8.0 g/L） 23. 6 mL
注： A液與B液相混即為pH6.8的緩沖液。
?。?）接種與培養(yǎng)：將試驗菌接種于肉汁胨斜面，適溫培養(yǎng)24 h。
?。?）測定方法：取干凈的試管2支，每管中加4滴L-色氨酸溶液和4滴生理鹽水（或4滴pH6. 8緩沖液），然后將測定菌的菌苔混到上述溶液的2支試管中制成濃溶液。另2支試管中不加菌苔作為對照。置室溫15 min ~20 min后，每管中加入1滴三氯化鐵（33%）溶液，立即呈現(xiàn)紅褐色，表示陽性反應(yīng)，不變色者表示陰性反應(yīng)?？捎米冃尉鳛殛栃詫φ铡?br>
（十八）氰化鉀試驗
原理：氰化鉀可以抑制某些細菌的呼吸酶系統(tǒng)。細胞色素、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶均以鐵卟啉作為輔基，氰化鉀能和鐵卟淋結(jié)合，使這些酶失去活性，使細菌生長受到抑制。
培養(yǎng)基：
蛋白胨 10.0g;
KH2 PO4 0. 225 g
Na2HPO4 5.64 g
蒸餾水 1000 mL
NaCl 5.0g。
此為基礎(chǔ)液。調(diào)節(jié)pH至7.6, 121℃滅菌15 min,冷卻，置冰箱。
于冷基礎(chǔ)液中加以15 mL. 0. 5%氰化鉀溶液（0.5g氰化鉀溶于100 ml.冷卻的滅菌蒸餾水中），分裝于滅菌小試管，每管約1 ml,立即用隨有熱石蠟的軟木寒塞緊，可于冰箱中保存2周。
方法：將20 h-24 h肉湯培養(yǎng)物，接種。大環(huán)到氰化鉀培養(yǎng)基中，立即用軟木塞塞緊，置37 ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察2d,有細菌生長時為陽性反應(yīng)。大多數(shù)沙門氏菌在此培養(yǎng)基中不能生長，即無渾濁現(xiàn)象。
注意：氰化鉀為劇毒藥，宜在通氣櫥內(nèi)操作。由于氰化鉀有劇毒，接觸皮膚的傷口或吸入微量粉末即可中毒死亡。與酸接觸分解能放出劇毒的氰化氫氣體，與氯酸鹽或亞硝酸鈉混合能發(fā)生爆炸。如果必須要進行氰化鉀試驗，使用的都為氰化鉀的替代品。
（十九）鳥氨酸、賴氨酸和精氨酸脫羧酶試驗
1.培養(yǎng)基
渙甲酚紫（1.6% ） 0.625 mL
甲酚紅（0.2% ） 2.5ml
蛋白胨 5g
瓊脂（半固體） 3g~6g
D-葡萄糖 0.5 g
牛肉膏 5g
蒸餾水 1000 mL
維生素B6 （吡哆醛Pyridoxal） 5 mg;
將以上成分加熱溶解，調(diào)pH為6,再加指示劑。將上列基礎(chǔ)培養(yǎng)基分為四等份，其中三份分別加入： L-鳥氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸的鹽酸鹽，使?jié)舛冗_到1%.如用DL型氨基酸，則濃度達到2%。再調(diào)pH到6.0~6.3,未加氨基酸的一份基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照。分裝小試管，每管3 mL. ~4 ml, 121 ℃滅菌10 min,鳥氨酸的培養(yǎng)基中可能有少量絮狀沉淀，但無礙作用。
2.接種
用幼齡培養(yǎng)物作為種菌直接接種，接種后封油。對照管與測定管同時接種。
3.結(jié)果觀察
對腸桿菌科的細菌，一般于37 ℃培養(yǎng)4d,每天觀察。但對非臨床來源的菌可于30℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察7d.指示劑呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。一般腸桿菌科的細菌于1d-2d呈陽性反應(yīng)，但也有遲緩陽性者，培養(yǎng)3d-4d才出現(xiàn)陽性反應(yīng)，對照管應(yīng)呈黃色。
?。ǘ┚彼犭p水解酶試驗
1.培養(yǎng)基（索恩利Thornley）
K2HPO4 0.3g;
L-精氧酸鹽 10g
蛋白胨 1g
瓊脂 6g
NaCl 5g
蒸餾水 1000 mL;
酚紅 0.01 g;
L-精氧酸鹽 10g
pH7.0-7.2,分裝試管，培養(yǎng)基高度約4cm ~5 cm, 121 ℃滅菌15 min。
2.接種與培養(yǎng)
用幼齡種菌穿刺接種，并用滅菌凡士林油封管，適溫培養(yǎng)3d, 7d, 14 d觀察。
3.結(jié)果觀察
培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為紅色者為陽性，應(yīng)有不含精氨酸空白對照。
?。ǘ唬┻^氧化氫酶試驗
過氧化氫酶試驗又名接觸酶試驗，所用試劑為3%過氧化氫溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
實驗方法：挑取固體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán)，置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液2 mL,觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：于0.5 min內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。
?。ǘ┭獫{凝固酶試驗
血漿凝固酶常用于金黃色葡萄球菌的檢測，當發(fā)現(xiàn)可疑菌落時，挑取平板上的可疑菌落1個或以上，分別接種到5 ml腦心浸液肉湯（BHI）和營養(yǎng)瓊脂小斜面， 36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)8 h-24 h。
取新鮮配置的免血漿（現(xiàn)在有很多廠商生產(chǎn)的方便使用的凍干兔血漿） 0.5 mL,放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2 ml~0. 3 mL,振蕩搖勻，置36 ℃ ±1 ℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每0.5 h觀察一次，觀察6h,如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。使用商品化的試劑時，按說明書進行操作。
結(jié)果如果可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5 mL, BHI, 36℃ ±1 ℃培養(yǎng)18 h-48 h,重復(fù)試驗。
微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)有：
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各種微生物因含有不同的分解糖（醇、苷）類的酶，所以分解糖類的能力各不相同，而且分解相應(yīng)糖類后形成的終末產(chǎn)物亦隨細菌種類而異，有的產(chǎn)酸，有的還可以產(chǎn)生氣體，因此可作為鑒別細菌的依據(jù)，對腸道桿菌的鑒別尤為常見?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。
試驗方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基魯，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36℃ ±1.0 ℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力，培養(yǎng)物可呈彌散生長。
本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫、溴百里藍和An-drade指示劑。
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某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。
試驗方法：以18h~24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區(qū)接種，試驗數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36℃ ±1 ℃培養(yǎng)24 h ~48 h,或于20℃培養(yǎng)5d。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)基表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍色。
淀粉水解系逐步進行的過程，因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7. 2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。
（三） V-P試驗
某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應(yīng)。
1.O'Meara氏法
將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)液1 mL加O'Meara試劑（加油0.3%肌酸或肌酸酐的40%氫氧化鈉水溶液）1mL，搖動試管1min~2min，靜置于室溫或36 ℃ ±1 ℃恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅即判定為陰性。亦有主張在48 ℃-50 ℃水浴放置2h后判定結(jié)果者。
2. Barritt氏法
將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36℃ ±1 ℃培養(yǎng)4 d,取培養(yǎng)液2.5 mL先加入5% α-萘酚純酒精溶液0.6%mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.2mL，搖動2min~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36 ℃ ±1 ℃恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色可判定為陰性。
3.快速法
將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中，挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5% a-萘酚3滴， 40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5 min,判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。
本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽孢桿菌和葡萄球菌等其他細菌時，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基甲醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。本試驗常與甲基紅試驗一起使用。本試驗陽性，甲基紅試驗陰性，反之亦然。
（四） 甲基紅試驗
腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH 下降至4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。
試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36 ℃ ±1 ℃或30℃ （以30℃較好） 3d-5d,從第二天起，每日取培養(yǎng)液1 mL,加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性即可判定結(jié)果。
甲基紅為酸性指示劑， pH范圍為4.4-6.0,其pH為5.0,故在pH5.0以下，隨酸度增加而紅色增強，在pH5.0以上，則隨堿度增加而黃色增強，在pH5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗。
（五）靛基質(zhì)試驗
某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于36℃ ±1 ℃培養(yǎng)24 h后，取約2 mL培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2滴~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性；或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。
實驗證明靛基質(zhì)試劑可與17種不同的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。
?。┫跛猁}還原試驗
有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。
1.試驗方法
臨試前將試劑的A （磺胺酸冰乙酸溶液）和B （a-萘胺乙醇溶液）試液各0.2 mL等量混合，取混合試劑約0.1 mL,加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10 min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。
用a-萘胺進行試驗時，陽性紅色消退很快，故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。a-萘胺具有致癌性，故使用時應(yīng)加注意。
2.試驗方法
將含有0.02%-0.2%硝酸鉀的蛋白胨水分裝至試管中，每支試管預(yù)先放一個倒置的發(fā)酵管，然后在121℃高壓滅菌15 min.按肉湯培養(yǎng)基方法接種，連同已滅菌的對照管一起在最佳生長溫度培養(yǎng)2d-7d,在接種管和對照管中加上Griess Ilosvay試劑1 mL或亞硝酸鹽試紙，幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色表明亞硝酸鹽產(chǎn)生。對照管應(yīng)為微紅色或無色。
陰性結(jié)果應(yīng)進行確證。向試管中加入微量鋅粉，將殘存的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，出現(xiàn)紅色表明有硝酸鹽存在；如沒有顏色變化，則說明沒有硝酸鹽存在，硝酸鹽已被微生物還原成亞硝酸鹽。發(fā)酵管中有氣體產(chǎn)生表明有氮氣生成。
?。ㄆ撸┟髂z液化試驗
有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。
1.營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基
在營養(yǎng)肉湯中加入10% ~15%的明膠，調(diào)節(jié)pH至7.2, 115℃高壓滅菌20 min。
試驗方法：挑取18 h-24 h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養(yǎng)基。于20℃-22 ℃培養(yǎng)7 d~14d,明膠高層亦可培養(yǎng)于36 ℃ ±1 ℃。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時應(yīng)不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后，再觀察其是否被細菌液化，如確被液化，即為試驗陽性。平板試驗結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點種的菌落上滴加試劑，若為陽性， 10 min -20 min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)，否則為
陰性。
2. Frazier明膠瓊脂（改良型）培養(yǎng)基
在營養(yǎng)瓊脂中加入0.4%明膠，調(diào)節(jié)pH至7.2, 115 ℃高壓滅菌20 min。
試驗方法：在已倒好干燥培養(yǎng)基的平皿上劃線接種或點接種。在最佳生長溫度下培養(yǎng)2d-14d。使用8mL~10 mL1%鹽酸（HCI不像氯化汞溶液那樣能很快的產(chǎn)生清晰的沉淀，但本書仍建議使用鹽酸，這是為了避免汞鹽的毒性及對環(huán)境造成的危害）試劑充滿培養(yǎng)皿，沒有水解的明膠與試劑慢慢形成不透明的白色沉淀，水解的明膠部分呈現(xiàn)了一個清晰的環(huán)帶。以毫米為單位記錄從菌落邊緣到環(huán)帶邊緣的清晰帶的大小。
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有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解，產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.00。
試驗方法：挑取18 h-24 h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖勻，于36℃±1℃培養(yǎng)10 min,、60 min和120 min,分別觀察結(jié)果；或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2 h、4h和24 h分別觀察結(jié)果，變?yōu)榉奂t色為陽性，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4d,做最終判定。
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氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這個試驗最適用于假單胞菌屬和其他革蘭氏陰性桿菌的鑒別。
試驗方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1滴~2滴，陽性者Ko-vacs氏試劑呈粉紅色-深紫色， Ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)為判定試驗結(jié)果。
（十）硫化氫試驗
有些細菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。在腸桿菌科的細菌鑒別中有重要作用。
試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36℃ ±1℃培養(yǎng)24 h-28 h,培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6d。也可用乙酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將乙酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會被濺濕為適度，用管塞住置36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)為1d-6d,紙條變黑為陽性。
（十一）三糖鐵（TSI ）瓊脂試驗
試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36℃ ±1 ℃培養(yǎng)18 h-24 h,觀察結(jié)果。
本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃），產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。
注意： TSI瓊脂培養(yǎng)基可以代替Kligler鐵瓊脂檢測硫化氫的產(chǎn)生。但是，檸檬酸桿菌和變形桿菌屬中的一些產(chǎn)硫化氫的菌株，在TSI瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生的硫化氫會被蔗糖發(fā)酵產(chǎn)物所掩蓋，因此，在做這些菌的產(chǎn)硫化氫試驗時， Kligler鐵瓊脂是更為可靠的試驗培養(yǎng)基。
（十二）硫化氫-靛基質(zhì)一動力瓊脂試驗
試驗方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約二分之一深度，置36 ℃ ±1℃培養(yǎng)18h-24 h,觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10 min,若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。
本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。
?。ㄊ幟仕猁}利用試驗
以檸檬酸鈉為唯一碳源、pH 7.0的培養(yǎng)基上，某些細菌能分解檸檬酸鈉產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中指示劑溴麝香草酚藍由淺綠色變?yōu)樯钏{色，此為檸檬酸鹽利用試驗陽性。如不能利用檸檬酸鹽，此試驗為陰性反應(yīng)。將細菌分別接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上，于37℃培養(yǎng)1d-4d,每日觀察結(jié)果。培養(yǎng)基斜面上有細菌生長，而且培養(yǎng)基變成藍色為陽性；無細菌生長，培養(yǎng)基顏色不變保持綠色為陰性。
?。ㄊ模┼徬趸?8-D吡喃半乳糖苷酶測定
乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和B-半乳糖苷酶才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-B-D-半乳糖苷（0-nitophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于檸檬酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。
將0.6 g ONPG溶解于100 mL,磷酸緩沖液內(nèi)，過濾滅菌后，與300 ml.蛋白胨水混合，無菌分裝小試管，于冰箱內(nèi)保存，備用， 1年內(nèi)使用有效。挑取幼齡斜面培養(yǎng)物一環(huán)于上述培養(yǎng)基內(nèi)，適溫培養(yǎng)24 h;制備濃的菌懸液（于0.5 mL生理鹽水的細管）中加ONPG紙片，35 ℃-37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。黃色為陽性，無色為陰性。也可直接將培養(yǎng)物接種ONPG試劑， 35℃-37 ℃培養(yǎng)1 h-3h即可以觀察結(jié)果，如為陰性繼續(xù)培養(yǎng)至24h,培養(yǎng)基變黃則為陽性。
（十五）膽汁-七葉苷水解試驗
在10% ~40%膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細菌分解生成七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵的二價鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。主要用于鑒況D群鏈球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如：脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。D群鏈球菌本試驗為陽性。
將被檢菌接種于膽汁-七葉苷培養(yǎng)基中， 35℃孵育18h~24 h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。
（十六）苯丙氨酸脫氨酶試驗
苯丙氨酸脫氨酶試驗可用于鑒別腸道細菌，例如對大腸桿菌與變形桿菌的鑒別。變形桿菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨，產(chǎn)生苯丙酮酸；而大腸桿菌不具有苯丙酸脫氨酶，不能將苯丙氨酸氧化脫氨，故不能產(chǎn)生苯丙酮酸。
具體操作為：將大腸桿菌和普通變形桿菌分別接種到苯丙氨酸斜面培養(yǎng)基上（注意接種量要大），置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)4h （或18 h-24 h）。觀察結(jié)果時，在培養(yǎng)好的菌種斜面上滴加2滴-3滴10%一氯化鐵溶液，試液自培養(yǎng)物上方流到下方，苯丙酮酸遇三氯化鐵形成綠色化合物，此為陽性反應(yīng)；若培養(yǎng)基不出現(xiàn)顏色變化，則為陰性反應(yīng)。
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此法可同時測定色氨酸脫羧酶、脲酶和吲哚3個項目。
1.方法一
（1）培養(yǎng)基
L-色氫酸 3g； NaCl 5g；
KH2PO4 1g; 乙醇（95% ） 10 mL:
K2 HPO4 1g; 蒸餾水 900 mL
加酚紅（25 mg~30 mg）至微橙的黃色， pH約為6.8~6.9,分裝于三角瓶中， 121 ℃蒸氣滅菌20 min。另將20g尿素溶于100 mL水中，過濾滅菌，用無菌操作與上述熱滅菌的培養(yǎng)基相混，并分裝于無菌試管內(nèi)，每管液層高約3cm ~4 cm。
?。?）接種與測定：將試驗菌株的幼齡培養(yǎng)物接種于上述培養(yǎng)液中，適溫培養(yǎng)24 h,取2滴~4滴培養(yǎng)液，與1滴三氯化鐵溶液（約33% ）相混。如呈紅褐色，則為色氨酸脫氨酶陽性反應(yīng)。如無顏色變化則為陰性反應(yīng)?？捎米冃尉鳛殛栃詫φ?。
?。?）結(jié)果觀察：如培養(yǎng)后的培養(yǎng)液由黃色轉(zhuǎn)紅色，表示有脲酶存在。如用對甲基氨基苯甲醛試劑測定，可檢查有無吲哚形成。如不擬測定脲酶，配制培養(yǎng)基時可不加酚紅和尿素。
2.方法二
?。?）試液
L-色氨酸 0.2% -0.5%
FeCl3 33%
生理鹽水或pH6. 8緩沖液
A液： KH2PO4, 0.2 mol/L （27. 2 g/L） 50 mL
B液： Na2 CO3, 0. 2 mol/L （8.0 g/L） 23. 6 mL
注： A液與B液相混即為pH6.8的緩沖液。
?。?）接種與培養(yǎng)：將試驗菌接種于肉汁胨斜面，適溫培養(yǎng)24 h。
?。?）測定方法：取干凈的試管2支，每管中加4滴L-色氨酸溶液和4滴生理鹽水（或4滴pH6. 8緩沖液），然后將測定菌的菌苔混到上述溶液的2支試管中制成濃溶液。另2支試管中不加菌苔作為對照。置室溫15 min ~20 min后，每管中加入1滴三氯化鐵（33%）溶液，立即呈現(xiàn)紅褐色，表示陽性反應(yīng)，不變色者表示陰性反應(yīng)?？捎米冃尉鳛殛栃詫φ铡?br>
（十八）氰化鉀試驗
原理：氰化鉀可以抑制某些細菌的呼吸酶系統(tǒng)。細胞色素、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶均以鐵卟啉作為輔基，氰化鉀能和鐵卟淋結(jié)合，使這些酶失去活性，使細菌生長受到抑制。
培養(yǎng)基：
蛋白胨 10.0g;
KH2 PO4 0. 225 g
Na2HPO4 5.64 g
蒸餾水 1000 mL
NaCl 5.0g。
此為基礎(chǔ)液。調(diào)節(jié)pH至7.6, 121℃滅菌15 min,冷卻，置冰箱。
于冷基礎(chǔ)液中加以15 mL. 0. 5%氰化鉀溶液（0.5g氰化鉀溶于100 ml.冷卻的滅菌蒸餾水中），分裝于滅菌小試管，每管約1 ml,立即用隨有熱石蠟的軟木寒塞緊，可于冰箱中保存2周。
方法：將20 h-24 h肉湯培養(yǎng)物，接種。大環(huán)到氰化鉀培養(yǎng)基中，立即用軟木塞塞緊，置37 ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察2d,有細菌生長時為陽性反應(yīng)。大多數(shù)沙門氏菌在此培養(yǎng)基中不能生長，即無渾濁現(xiàn)象。
注意：氰化鉀為劇毒藥，宜在通氣櫥內(nèi)操作。由于氰化鉀有劇毒，接觸皮膚的傷口或吸入微量粉末即可中毒死亡。與酸接觸分解能放出劇毒的氰化氫氣體，與氯酸鹽或亞硝酸鈉混合能發(fā)生爆炸。如果必須要進行氰化鉀試驗，使用的都為氰化鉀的替代品。
（十九）鳥氨酸、賴氨酸和精氨酸脫羧酶試驗
1.培養(yǎng)基
渙甲酚紫（1.6% ） 0.625 mL
甲酚紅（0.2% ） 2.5ml
蛋白胨 5g
瓊脂（半固體） 3g~6g
D-葡萄糖 0.5 g
牛肉膏 5g
蒸餾水 1000 mL
維生素B6 （吡哆醛Pyridoxal） 5 mg;
將以上成分加熱溶解，調(diào)pH為6,再加指示劑。將上列基礎(chǔ)培養(yǎng)基分為四等份，其中三份分別加入： L-鳥氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸的鹽酸鹽，使?jié)舛冗_到1%.如用DL型氨基酸，則濃度達到2%。再調(diào)pH到6.0~6.3,未加氨基酸的一份基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照。分裝小試管，每管3 mL. ~4 ml, 121 ℃滅菌10 min,鳥氨酸的培養(yǎng)基中可能有少量絮狀沉淀，但無礙作用。
2.接種
用幼齡培養(yǎng)物作為種菌直接接種，接種后封油。對照管與測定管同時接種。
3.結(jié)果觀察
對腸桿菌科的細菌，一般于37 ℃培養(yǎng)4d,每天觀察。但對非臨床來源的菌可于30℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察7d.指示劑呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。一般腸桿菌科的細菌于1d-2d呈陽性反應(yīng)，但也有遲緩陽性者，培養(yǎng)3d-4d才出現(xiàn)陽性反應(yīng)，對照管應(yīng)呈黃色。
?。ǘ┚彼犭p水解酶試驗
1.培養(yǎng)基（索恩利Thornley）
K2HPO4 0.3g;
L-精氧酸鹽 10g
蛋白胨 1g
瓊脂 6g
NaCl 5g
蒸餾水 1000 mL;
酚紅 0.01 g;
L-精氧酸鹽 10g
pH7.0-7.2,分裝試管，培養(yǎng)基高度約4cm ~5 cm, 121 ℃滅菌15 min。
2.接種與培養(yǎng)
用幼齡種菌穿刺接種，并用滅菌凡士林油封管，適溫培養(yǎng)3d, 7d, 14 d觀察。
3.結(jié)果觀察
培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為紅色者為陽性，應(yīng)有不含精氨酸空白對照。
?。ǘ唬┻^氧化氫酶試驗
過氧化氫酶試驗又名接觸酶試驗，所用試劑為3%過氧化氫溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
實驗方法：挑取固體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán)，置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液2 mL,觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：于0.5 min內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。
?。ǘ┭獫{凝固酶試驗
血漿凝固酶常用于金黃色葡萄球菌的檢測，當發(fā)現(xiàn)可疑菌落時，挑取平板上的可疑菌落1個或以上，分別接種到5 ml腦心浸液肉湯（BHI）和營養(yǎng)瓊脂小斜面， 36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)8 h-24 h。
取新鮮配置的免血漿（現(xiàn)在有很多廠商生產(chǎn)的方便使用的凍干兔血漿） 0.5 mL,放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2 ml~0. 3 mL,振蕩搖勻，置36 ℃ ±1 ℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每0.5 h觀察一次，觀察6h,如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。使用商品化的試劑時，按說明書進行操作。
結(jié)果如果可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5 mL, BHI, 36℃ ±1 ℃培養(yǎng)18 h-48 h,重復(fù)試驗。
