近日，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜所西瓜課題組在植物學(xué)國際知名期刊The Plant Cell在線發(fā)表了題為A natural variant of NON-RIPENING promotes fruit ripening in watermelon的研究論文，該研究闡明了NAC轉(zhuǎn)錄因子ClNOR及其自然變異位點(diǎn)調(diào)控西瓜果實(shí)成熟進(jìn)化的機(jī)制。
果實(shí)成熟分為呼吸躍變型和非呼吸躍變型兩種類型。在番茄為代表的呼吸躍變型模式作物上，陸續(xù)挖掘出調(diào)控呼吸躍變型果實(shí)成熟關(guān)鍵因子NAC轉(zhuǎn)錄因子NOR，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子RIN等明星基因，逐步完善了其調(diào)控果實(shí)成熟的作用機(jī)制?；谶@些基因開發(fā)的相關(guān)標(biāo)記已在育種上得以應(yīng)用，乙烯利與1-MCP等生長調(diào)節(jié)劑也在產(chǎn)業(yè)上得到了廣泛實(shí)際應(yīng)用。相較于呼吸躍變型果實(shí)，調(diào)控非呼吸躍變型果實(shí)成熟的關(guān)鍵基因及其進(jìn)化分子機(jī)制長期未能破解。西瓜是典型的非呼吸躍變果實(shí)，通過進(jìn)化與人為選擇，由非洲起源的野生西瓜進(jìn)化為瓤色鮮艷、口感酥脆、含糖量高的栽培西瓜，其進(jìn)化分子機(jī)制是改良與提高西瓜品質(zhì)的理論基礎(chǔ)，但控制西瓜果實(shí)成熟進(jìn)化的主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子及其分子機(jī)制尚不清楚。
本研究通過分析414份代表性西瓜的重測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，共有9個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子在西瓜成熟進(jìn)化階段受到選擇。其中四個(gè)NAC基因ClNAC53, ClNAC56, ClNAC68和ClNAC100，位于品質(zhì)提高進(jìn)化階段，且在果肉中高量表達(dá)。將四個(gè)基因分別敲除后發(fā)現(xiàn)，只有Clnac56突變體果實(shí)品質(zhì)顯著降低。無獨(dú)有偶，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，ClNAC56正是番茄SlNOR的同源基因，因此將該基因命名為ClNOR。ClNOR如何參與調(diào)控西瓜果實(shí)成熟以及自然變異位點(diǎn)在西瓜果實(shí)成熟進(jìn)化過程中起怎么樣的作用是本項(xiàng)研究核心問題。
首先利用基因編輯技術(shù)驗(yàn)證其功能，敲除ClNOR，西瓜果實(shí)成熟顯著推遲，果實(shí)含糖量、番茄紅素含量及ABA含量均顯著下降。進(jìn)一步通過DAP-seq分析發(fā)現(xiàn)，ClNOR不能直接結(jié)合果實(shí)成熟相關(guān)功能基因，如ABA合成基因ClNCED1，番茄紅素合成基因ClPSY1，有色體發(fā)育基因ClPHT4;2以及西瓜果實(shí)糖含量基因ClAGA2等。這與番茄SlNOR直接靶向決定果實(shí)成熟關(guān)鍵功能基因的機(jī)制不同。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步挖掘到ClbZIP1是連接ClNOR與ABA合成基因ClNCED1和有色體發(fā)育關(guān)鍵基因ClPHT4;2的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。敲除Clbzip1果實(shí)成熟推遲，品質(zhì)顯著下降。與Clnor雜交，獲得的Clnor Clbzip1雙突體其推遲果實(shí)成熟的表型比clbzip1單突變體更為顯著，但與Clnor單突變體表型無顯著差異。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)ClNOR通過介導(dǎo)ClbZIP1來調(diào)控ClNCED1和ClPHT4;2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)西瓜果實(shí)ABA積累和瓤色形成。同時(shí)，ClNOR通過ClNOR-ClNF-YC2-ClAGA2模塊來調(diào)控果實(shí)含糖量的機(jī)制。
本研究進(jìn)一步開展了ClNOR自然變異位點(diǎn)調(diào)控下游基因的機(jī)制研究，通過單倍型分析發(fā)現(xiàn)，ClNOR轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域存在兩個(gè)自然變異位點(diǎn)，產(chǎn)生了三種單倍型，即栽培類型ClNORT,T, landrace類型ClNORC,T和祖先類型 ClNORC,G。生物膜干涉實(shí)驗(yàn)及雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)明確栽培類型ClNORT,T對(duì)靶基因ClbZIP1的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著高于landrace類型ClNORC,T和祖先類型ClNORC,G。回補(bǔ)番茄Slnor基因編輯突變體發(fā)現(xiàn)，只有栽培類型ClNORT,T能夠恢復(fù)Slnor成熟推遲的表型，landrace類型ClNORC,T和祖先類型ClNORC,G則不能恢復(fù)。這進(jìn)一步證實(shí)了ClNOR自然變異位點(diǎn)（564,T/C）通過增強(qiáng)對(duì)靶基因的激活作用來促進(jìn)果實(shí)成熟。
非呼吸躍變型果實(shí)還包含包括柑橘、葡萄、草莓、辣椒等許多重要水果蔬菜，種植面積與產(chǎn)量約占全球果蔬一半以上，但由于大部分作物還存在無性繁殖以及遺傳轉(zhuǎn)化困難等難題，一直限制了非呼吸躍變型果實(shí)成熟進(jìn)化機(jī)制研究進(jìn)展。本研究首次系統(tǒng)闡明了NAC轉(zhuǎn)錄因子ClNOR調(diào)控非呼吸躍變型西瓜果實(shí)成熟進(jìn)化的分子機(jī)制，必將推動(dòng)非呼吸躍變型果實(shí)成熟與品質(zhì)形成研究引向深入。
我院蔬菜研究所王晉芳副研究員和于泳濤副研究員為該論文第一作者，許勇研究員為通訊作者。團(tuán)隊(duì)郭紹貴研究員、張潔研究員、任毅研究員等做出突出貢獻(xiàn)。感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)傅達(dá)奇教授團(tuán)隊(duì)提供的番茄slnac-nor基因編輯突變體及對(duì)本文提出的寶貴意見。本研究受到國家自然科學(xué)基金、北京市農(nóng)業(yè)局項(xiàng)目，北京市農(nóng)林科學(xué)院優(yōu)秀青年等項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/plcell/koae313
日期：2024-12-04
果實(shí)成熟分為呼吸躍變型和非呼吸躍變型兩種類型。在番茄為代表的呼吸躍變型模式作物上，陸續(xù)挖掘出調(diào)控呼吸躍變型果實(shí)成熟關(guān)鍵因子NAC轉(zhuǎn)錄因子NOR，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子RIN等明星基因，逐步完善了其調(diào)控果實(shí)成熟的作用機(jī)制?；谶@些基因開發(fā)的相關(guān)標(biāo)記已在育種上得以應(yīng)用，乙烯利與1-MCP等生長調(diào)節(jié)劑也在產(chǎn)業(yè)上得到了廣泛實(shí)際應(yīng)用。相較于呼吸躍變型果實(shí)，調(diào)控非呼吸躍變型果實(shí)成熟的關(guān)鍵基因及其進(jìn)化分子機(jī)制長期未能破解。西瓜是典型的非呼吸躍變果實(shí)，通過進(jìn)化與人為選擇，由非洲起源的野生西瓜進(jìn)化為瓤色鮮艷、口感酥脆、含糖量高的栽培西瓜，其進(jìn)化分子機(jī)制是改良與提高西瓜品質(zhì)的理論基礎(chǔ)，但控制西瓜果實(shí)成熟進(jìn)化的主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子及其分子機(jī)制尚不清楚。
本研究通過分析414份代表性西瓜的重測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，共有9個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子在西瓜成熟進(jìn)化階段受到選擇。其中四個(gè)NAC基因ClNAC53, ClNAC56, ClNAC68和ClNAC100，位于品質(zhì)提高進(jìn)化階段，且在果肉中高量表達(dá)。將四個(gè)基因分別敲除后發(fā)現(xiàn)，只有Clnac56突變體果實(shí)品質(zhì)顯著降低。無獨(dú)有偶，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，ClNAC56正是番茄SlNOR的同源基因，因此將該基因命名為ClNOR。ClNOR如何參與調(diào)控西瓜果實(shí)成熟以及自然變異位點(diǎn)在西瓜果實(shí)成熟進(jìn)化過程中起怎么樣的作用是本項(xiàng)研究核心問題。
首先利用基因編輯技術(shù)驗(yàn)證其功能，敲除ClNOR，西瓜果實(shí)成熟顯著推遲，果實(shí)含糖量、番茄紅素含量及ABA含量均顯著下降。進(jìn)一步通過DAP-seq分析發(fā)現(xiàn)，ClNOR不能直接結(jié)合果實(shí)成熟相關(guān)功能基因，如ABA合成基因ClNCED1，番茄紅素合成基因ClPSY1，有色體發(fā)育基因ClPHT4;2以及西瓜果實(shí)糖含量基因ClAGA2等。這與番茄SlNOR直接靶向決定果實(shí)成熟關(guān)鍵功能基因的機(jī)制不同。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步挖掘到ClbZIP1是連接ClNOR與ABA合成基因ClNCED1和有色體發(fā)育關(guān)鍵基因ClPHT4;2的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。敲除Clbzip1果實(shí)成熟推遲，品質(zhì)顯著下降。與Clnor雜交，獲得的Clnor Clbzip1雙突體其推遲果實(shí)成熟的表型比clbzip1單突變體更為顯著，但與Clnor單突變體表型無顯著差異。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)ClNOR通過介導(dǎo)ClbZIP1來調(diào)控ClNCED1和ClPHT4;2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)西瓜果實(shí)ABA積累和瓤色形成。同時(shí)，ClNOR通過ClNOR-ClNF-YC2-ClAGA2模塊來調(diào)控果實(shí)含糖量的機(jī)制。
本研究進(jìn)一步開展了ClNOR自然變異位點(diǎn)調(diào)控下游基因的機(jī)制研究，通過單倍型分析發(fā)現(xiàn)，ClNOR轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域存在兩個(gè)自然變異位點(diǎn)，產(chǎn)生了三種單倍型，即栽培類型ClNORT,T, landrace類型ClNORC,T和祖先類型 ClNORC,G。生物膜干涉實(shí)驗(yàn)及雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)明確栽培類型ClNORT,T對(duì)靶基因ClbZIP1的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著高于landrace類型ClNORC,T和祖先類型ClNORC,G。回補(bǔ)番茄Slnor基因編輯突變體發(fā)現(xiàn)，只有栽培類型ClNORT,T能夠恢復(fù)Slnor成熟推遲的表型，landrace類型ClNORC,T和祖先類型ClNORC,G則不能恢復(fù)。這進(jìn)一步證實(shí)了ClNOR自然變異位點(diǎn)（564,T/C）通過增強(qiáng)對(duì)靶基因的激活作用來促進(jìn)果實(shí)成熟。
非呼吸躍變型果實(shí)還包含包括柑橘、葡萄、草莓、辣椒等許多重要水果蔬菜，種植面積與產(chǎn)量約占全球果蔬一半以上，但由于大部分作物還存在無性繁殖以及遺傳轉(zhuǎn)化困難等難題，一直限制了非呼吸躍變型果實(shí)成熟進(jìn)化機(jī)制研究進(jìn)展。本研究首次系統(tǒng)闡明了NAC轉(zhuǎn)錄因子ClNOR調(diào)控非呼吸躍變型西瓜果實(shí)成熟進(jìn)化的分子機(jī)制，必將推動(dòng)非呼吸躍變型果實(shí)成熟與品質(zhì)形成研究引向深入。
我院蔬菜研究所王晉芳副研究員和于泳濤副研究員為該論文第一作者，許勇研究員為通訊作者。團(tuán)隊(duì)郭紹貴研究員、張潔研究員、任毅研究員等做出突出貢獻(xiàn)。感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)傅達(dá)奇教授團(tuán)隊(duì)提供的番茄slnac-nor基因編輯突變體及對(duì)本文提出的寶貴意見。本研究受到國家自然科學(xué)基金、北京市農(nóng)業(yè)局項(xiàng)目，北京市農(nóng)林科學(xué)院優(yōu)秀青年等項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/plcell/koae313
日期：2024-12-04
