近日，Trends in Biotechnology在線發(fā)表了江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心和生物工程學(xué)院陳堅院士團隊的綜述Recent advances in the microbial synthesisof hemoglobin。趙鑫銳副研究員為第一作者，周景文教授為通訊作者，論文作者還包括陳堅教授和堵國成教授。
血紅蛋白是一類存在于原核和真核細胞中的以血紅素為輔基的含鐵金屬蛋白，在生物體內(nèi)具有運輸和儲存氧、調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH值、調(diào)控生理代謝等諸多重要功能。近年來，血紅蛋白已經(jīng)被應(yīng)用于急診醫(yī)學(xué)（作為無細胞氧載體）、醫(yī)療保?。ㄗ鳛殍F補給劑）、食品加工（食品級著色和調(diào)味劑）等領(lǐng)域。但血紅蛋白的獲取依然需要依靠從血液或植物組織中提取，提取法不僅費時低效、并且所用化學(xué)試劑還易造成環(huán)境污染。因此，以微生物細胞工廠為平臺來合成不同來源的血紅蛋白已經(jīng)成為近年來的研究熱點。
在NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有超過141110條的血紅蛋白基因編碼序列，在EMBL蛋白數(shù)據(jù)庫中已有超過84424條的血紅蛋白氨基酸序列，在PDB蛋白晶體數(shù)據(jù)庫中也已經(jīng)有725條血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，但現(xiàn)階段其中只有15種不同來源（人、大豆、鱷魚等）的血紅蛋白可由9種有限的微生物（大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌等）合成。根據(jù)對現(xiàn)有血紅蛋白氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)不同來源的血紅蛋白及其亞基分為幾類：動物來源血紅蛋白α亞基、β亞基以及其他類型亞基，植物來源單亞基血紅蛋白、微生物來源血紅蛋白（圖1）。因此，可以綜合應(yīng)用目前越來越成熟的代謝工程和合成生物學(xué)策略，開發(fā)出有效且穩(wěn)定的血紅蛋白微生物合成方法，來滿足對人、大豆、透明顫菌等不同物種血紅蛋白的大規(guī)模應(yīng)用的需求。
血紅素是血紅蛋白執(zhí)行其生理功能所必須的輔基，要想高效合成血紅蛋白首先需要提高胞內(nèi)血紅素的供給水平。在自然界中血紅素的合成主要通過C4和C5兩種途徑（圖2），通過強化C4途徑并補加甘氨酸和琥珀酸作為底物或強化抗反饋抑制的C5途徑都可以增加胞內(nèi)血紅素前體5-氨基酮戊酸（ALA）的含量。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)強化并模塊化改造血紅素合成的下游途徑，可在大腸桿菌中不添加底物的情況下實現(xiàn)115.5±2.3mg/L血紅素的合成。此外，由于胞內(nèi)過高含量的血紅素會顯著抑制菌體的生長，利用血紅素轉(zhuǎn)運蛋白可以實現(xiàn)超過60%血紅素的分泌合成，以減輕血紅素對細胞的毒性作用。
在提高血紅素供給水平的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌、酵母等微生物宿主合成不同來源血紅蛋白已獲得成功。由于代謝改造成熟和培養(yǎng)成本低廉，目前超過70％的血紅蛋白均由大腸桿菌合成。首先為了增強大腸桿菌中血紅蛋白的可溶性，密碼子優(yōu)化、啟動子和載體的適配組合、以及蛋白促溶標簽均已被成功應(yīng)用來避免包涵體的形成；其次為了增強動物來源血紅蛋白α亞基的表達量，α亞基編碼基因的串聯(lián)表達和穩(wěn)定輔因子AHSP的共表達也已被用于提高α亞基的穩(wěn)定型；此外由于大腸桿菌宿主中血紅素的合成和運輸能力較弱，可以通過引入志賀假單胞菌的血紅素轉(zhuǎn)運系統(tǒng)并在胞外添加高濃度的血紅素，以增加細胞內(nèi)血紅素水平（圖3）。在初步獲得血紅蛋白的基礎(chǔ)上，還可以進一步通過：將人源血紅蛋白α亞基和牛源血紅蛋白β亞基相結(jié)合，開發(fā)出一種自聚合的人牛雜源血紅蛋白（180-500kDa聚合物）來延長商業(yè)化無細胞氧載體產(chǎn)品在血液中的半衰期；在宿主中共表達甲硫氨酸氨基肽酶以加速血紅蛋白N末端蛋氨酸殘基的正確切除；優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度等發(fā)酵條件來提高血紅蛋白的產(chǎn)量。
除大腸桿菌之外，釀酒酵母、畢赤酵母等酵母菌株也是合成血紅蛋白的高效平臺。但在前期研究中，釀酒酵母合成血紅蛋白的產(chǎn)量較低，近幾年通過優(yōu)化血紅蛋白α和β亞基之間表達水平的比率、強化血紅素合成途徑、敲除轉(zhuǎn)錄因子Hap1p改造氧氣傳感途徑（圖3），人源血紅蛋白的最高含量可以達到細胞中總可溶性蛋白的7％。畢赤酵母是目前生產(chǎn)商業(yè)化大豆血紅蛋白的高效宿主，所得大豆血紅蛋白可添加到新型人造肉產(chǎn)品中來模擬真肉的肉色和風(fēng)味。Impossible Foods公司開發(fā)的可以商業(yè)化合成大豆血紅蛋白的畢赤酵母菌株，已經(jīng)獲得了FDA的許可并在多個國家申請了專利。在該菌株中血紅素合成所需的八種酶被分為三個模塊，并分別用甲醇誘導(dǎo)的AOX1啟動子進行了強化表達；此外兩個拷貝的大豆血紅蛋白的基因和轉(zhuǎn)錄激活因子Mxr1p也被整合到基因組中；最后，通過優(yōu)化高密度發(fā)酵條件，實現(xiàn)了大豆血紅蛋白的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)（圖3）。
目前利用微生物來合成血紅蛋白雖然已經(jīng)獲得了成功，但大部分血紅蛋白的產(chǎn)量還較低，這對在生產(chǎn)中應(yīng)用重組血紅蛋白提出了重大挑戰(zhàn)。在未來的研究中可以采用新的策略來進行強化菌株的合成能力（圖4）：首先可以通過深度學(xué)習(xí)的方法發(fā)現(xiàn)編碼未知的具有特殊功能或特性的血紅蛋白基因，例如具有高溫不易變色特性的三葉草血紅蛋白等；其次應(yīng)繼續(xù)尋找血紅素合成途徑中的限速步驟，并應(yīng)用蛋白質(zhì)支架等策略解除這些步驟之間的空間隔離；再次應(yīng)抑制胞內(nèi)血紅素合成途徑中的副產(chǎn)物和血紅素加氧酶對血紅素的降解；最后由于血紅素對細胞有毒性作用，并且血紅素合成途徑中酶的過度表達會增加宿主的代謝負擔(dān)，因此應(yīng)用血紅素感應(yīng)器來實現(xiàn)血紅素合成和血紅蛋白表達之間的代謝平衡是突破血紅蛋白合成瓶頸的關(guān)鍵。
本綜述得到了國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFA0906400）、國家自然科學(xué)基金（31900067）、“輕工技術(shù)與工程1”國家一流學(xué)科項目（LITE2018-08）的資助，以“Recentadvances in the microbial synthesis of hemoglobin”為題發(fā)表在期刊Trendsin Biotechnology上（Trendsin Biotechnology, 2021, 39（3）， 286-297, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0167779920302262）。
日期：2021-02-19
血紅蛋白是一類存在于原核和真核細胞中的以血紅素為輔基的含鐵金屬蛋白，在生物體內(nèi)具有運輸和儲存氧、調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH值、調(diào)控生理代謝等諸多重要功能。近年來，血紅蛋白已經(jīng)被應(yīng)用于急診醫(yī)學(xué)（作為無細胞氧載體）、醫(yī)療保?。ㄗ鳛殍F補給劑）、食品加工（食品級著色和調(diào)味劑）等領(lǐng)域。但血紅蛋白的獲取依然需要依靠從血液或植物組織中提取，提取法不僅費時低效、并且所用化學(xué)試劑還易造成環(huán)境污染。因此，以微生物細胞工廠為平臺來合成不同來源的血紅蛋白已經(jīng)成為近年來的研究熱點。
在NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有超過141110條的血紅蛋白基因編碼序列，在EMBL蛋白數(shù)據(jù)庫中已有超過84424條的血紅蛋白氨基酸序列，在PDB蛋白晶體數(shù)據(jù)庫中也已經(jīng)有725條血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，但現(xiàn)階段其中只有15種不同來源（人、大豆、鱷魚等）的血紅蛋白可由9種有限的微生物（大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌等）合成。根據(jù)對現(xiàn)有血紅蛋白氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)不同來源的血紅蛋白及其亞基分為幾類：動物來源血紅蛋白α亞基、β亞基以及其他類型亞基，植物來源單亞基血紅蛋白、微生物來源血紅蛋白（圖1）。因此，可以綜合應(yīng)用目前越來越成熟的代謝工程和合成生物學(xué)策略，開發(fā)出有效且穩(wěn)定的血紅蛋白微生物合成方法，來滿足對人、大豆、透明顫菌等不同物種血紅蛋白的大規(guī)模應(yīng)用的需求。
血紅素是血紅蛋白執(zhí)行其生理功能所必須的輔基，要想高效合成血紅蛋白首先需要提高胞內(nèi)血紅素的供給水平。在自然界中血紅素的合成主要通過C4和C5兩種途徑（圖2），通過強化C4途徑并補加甘氨酸和琥珀酸作為底物或強化抗反饋抑制的C5途徑都可以增加胞內(nèi)血紅素前體5-氨基酮戊酸（ALA）的含量。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)強化并模塊化改造血紅素合成的下游途徑，可在大腸桿菌中不添加底物的情況下實現(xiàn)115.5±2.3mg/L血紅素的合成。此外，由于胞內(nèi)過高含量的血紅素會顯著抑制菌體的生長，利用血紅素轉(zhuǎn)運蛋白可以實現(xiàn)超過60%血紅素的分泌合成，以減輕血紅素對細胞的毒性作用。
在提高血紅素供給水平的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌、酵母等微生物宿主合成不同來源血紅蛋白已獲得成功。由于代謝改造成熟和培養(yǎng)成本低廉，目前超過70％的血紅蛋白均由大腸桿菌合成。首先為了增強大腸桿菌中血紅蛋白的可溶性，密碼子優(yōu)化、啟動子和載體的適配組合、以及蛋白促溶標簽均已被成功應(yīng)用來避免包涵體的形成；其次為了增強動物來源血紅蛋白α亞基的表達量，α亞基編碼基因的串聯(lián)表達和穩(wěn)定輔因子AHSP的共表達也已被用于提高α亞基的穩(wěn)定型；此外由于大腸桿菌宿主中血紅素的合成和運輸能力較弱，可以通過引入志賀假單胞菌的血紅素轉(zhuǎn)運系統(tǒng)并在胞外添加高濃度的血紅素，以增加細胞內(nèi)血紅素水平（圖3）。在初步獲得血紅蛋白的基礎(chǔ)上，還可以進一步通過：將人源血紅蛋白α亞基和牛源血紅蛋白β亞基相結(jié)合，開發(fā)出一種自聚合的人牛雜源血紅蛋白（180-500kDa聚合物）來延長商業(yè)化無細胞氧載體產(chǎn)品在血液中的半衰期；在宿主中共表達甲硫氨酸氨基肽酶以加速血紅蛋白N末端蛋氨酸殘基的正確切除；優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度等發(fā)酵條件來提高血紅蛋白的產(chǎn)量。
除大腸桿菌之外，釀酒酵母、畢赤酵母等酵母菌株也是合成血紅蛋白的高效平臺。但在前期研究中，釀酒酵母合成血紅蛋白的產(chǎn)量較低，近幾年通過優(yōu)化血紅蛋白α和β亞基之間表達水平的比率、強化血紅素合成途徑、敲除轉(zhuǎn)錄因子Hap1p改造氧氣傳感途徑（圖3），人源血紅蛋白的最高含量可以達到細胞中總可溶性蛋白的7％。畢赤酵母是目前生產(chǎn)商業(yè)化大豆血紅蛋白的高效宿主，所得大豆血紅蛋白可添加到新型人造肉產(chǎn)品中來模擬真肉的肉色和風(fēng)味。Impossible Foods公司開發(fā)的可以商業(yè)化合成大豆血紅蛋白的畢赤酵母菌株，已經(jīng)獲得了FDA的許可并在多個國家申請了專利。在該菌株中血紅素合成所需的八種酶被分為三個模塊，并分別用甲醇誘導(dǎo)的AOX1啟動子進行了強化表達；此外兩個拷貝的大豆血紅蛋白的基因和轉(zhuǎn)錄激活因子Mxr1p也被整合到基因組中；最后，通過優(yōu)化高密度發(fā)酵條件，實現(xiàn)了大豆血紅蛋白的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)（圖3）。
目前利用微生物來合成血紅蛋白雖然已經(jīng)獲得了成功，但大部分血紅蛋白的產(chǎn)量還較低，這對在生產(chǎn)中應(yīng)用重組血紅蛋白提出了重大挑戰(zhàn)。在未來的研究中可以采用新的策略來進行強化菌株的合成能力（圖4）：首先可以通過深度學(xué)習(xí)的方法發(fā)現(xiàn)編碼未知的具有特殊功能或特性的血紅蛋白基因，例如具有高溫不易變色特性的三葉草血紅蛋白等；其次應(yīng)繼續(xù)尋找血紅素合成途徑中的限速步驟，并應(yīng)用蛋白質(zhì)支架等策略解除這些步驟之間的空間隔離；再次應(yīng)抑制胞內(nèi)血紅素合成途徑中的副產(chǎn)物和血紅素加氧酶對血紅素的降解；最后由于血紅素對細胞有毒性作用，并且血紅素合成途徑中酶的過度表達會增加宿主的代謝負擔(dān)，因此應(yīng)用血紅素感應(yīng)器來實現(xiàn)血紅素合成和血紅蛋白表達之間的代謝平衡是突破血紅蛋白合成瓶頸的關(guān)鍵。
本綜述得到了國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFA0906400）、國家自然科學(xué)基金（31900067）、“輕工技術(shù)與工程1”國家一流學(xué)科項目（LITE2018-08）的資助，以“Recentadvances in the microbial synthesis of hemoglobin”為題發(fā)表在期刊Trendsin Biotechnology上（Trendsin Biotechnology, 2021, 39（3）， 286-297, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0167779920302262）。
日期：2021-02-19
