A． 實(shí)驗(yàn)過程一 實(shí)驗(yàn)原理：
2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同,而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離.這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息.
二 實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 樣品的溶解
取純化后的晶體蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右,共處理一個(gè)小時(shí).其中每隔10～15分鐘振蕩一次,然后13200rpm離心15min除雜質(zhì),取上清分裝,每管70ul,—80oC保存.
2. Bradford法測(cè)蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測(cè)定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白含量.取 7個(gè)10ml的離心管,首先在5個(gè)離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分別加入2 ul的待測(cè)樣品溶液,再在每管中加入相應(yīng)體積的雙蒸水（總體積為80ul）,然后,各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的 Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用）,搖勻,2min在595nm下,按由低到高的濃度順序測(cè)定各濃度BSA的OD值,再測(cè)樣品 OD值.(測(cè)量過程要在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成).
3. 雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水）
3.1 水化液的制備
稱取2.0mg 的DTT,用700ul水化液儲(chǔ)液溶解后,加入8ul 0.05％ 的溴酚蘭,3.5ul（0.5％v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻,13200rpm離心15min 除雜質(zhì),取上清.在含300ug 蛋白（經(jīng)驗(yàn)值）的樣品溶解液中加入水化液,至終體積為340ul,振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì),取上清.
3.2 點(diǎn)樣,上膠
分兩次吸取樣品,每次170ul, 按從正極到負(fù)極的順序加入點(diǎn)樣槽兩側(cè),再用鑷子撥開Immobiline DryStrip gels (18cm,pH 3—10)膠條,從正極到負(fù)極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品.注意：膠條使用前,要在室溫中平衡30分鐘；加樣時(shí),正極要多加樣,以防氣泡的產(chǎn)生；壓膠時(shí)不能產(chǎn)生氣泡；酸性端對(duì)應(yīng)正極,堿性端對(duì)應(yīng)負(fù)極；樣品加好后,加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad),兩個(gè)上樣槽必須與底線齊平.
3.3 IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為20℃）
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共計(jì)44110vhs, 19.5小時(shí)
其中S1用于泡脹水化膠條,S2和S3用于去小離子,S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后,在濾紙上吸干（膠面,即接觸樣品那一面不能接觸濾紙,如果為18cm的膠條要將兩頭剪去）,再以超純水沖洗,濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略）,然后用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下,負(fù)極端（即堿性端）向上,放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端,酸性端留有溴 酚蘭作為標(biāo)記）,用平衡液A,平衡液B先后平衡15min. 注:平衡時(shí)要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁.
平衡第二次時(shí),在沸水中煮Marker 3min,剪兩個(gè)同樣大小的小紙片,長(zhǎng)度與一向膠條的寬度等同,然后吸取煮好的Marker,轉(zhuǎn)入SDS—PAGE膠面上,保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時(shí),煮5％的瓊脂糖10ml.
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE
4.1 配膠(兩根膠條所用劑量)
分離膠：（T=8％ 80 ml）：溶液于真空機(jī)中抽氣后再加APS和TEMED
30 ％ 丙烯酰胺儲(chǔ)液 21.28ml
分離膠buffer 20ml 10％APS 220ul TEMED 44 ul
雙蒸水 38.72ml
濃縮膠：（T=4.8％ 10ml）
30 ％ 丙烯酰胺儲(chǔ)液 1.6ml
濃縮膠buffer 2.5ml 10％APS 30ul TEMED 5ul
雙蒸水 5.9ml
4.2 灌膠
將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇?jí)耗z,凝膠后(這時(shí)會(huì)出現(xiàn)三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇?jí)耗z,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保鮮膜封好.
4.3 轉(zhuǎn)移
剪兩個(gè)小的濾紙片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE膠面的一端.然后,將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5％的瓊脂糖溶液在膠面 上(瓊脂糖凝膠在轉(zhuǎn)移前十幾分鐘的時(shí)候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態(tài),至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠 面,其中不斷補(bǔ)加5％的瓊脂糖溶液,注意不能產(chǎn)生氣泡.
4.4 跑膠
濃縮膠 13mA 分離膠 20mA 共約5.5個(gè)小時(shí)
5. 銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水）
5.1 固定 30min 無水乙醇 200ml+乙酸50ml,用超純水定容至500ml
5.2 敏化 30min 無水乙醇 150ml
Na2S2O3•5H2O 1.5688g
無水乙酸鈉 34g
先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml
5.3 洗滌 5min × 3次
5.4 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至500ml
5.5 洗滌 1min × 2次
5.6 顯影 無水Na2CO3 12.5g 用超純水定容至500ml
甲醛(37％)0.1ml, 臨時(shí)加
5.7 終止 10min EDTA—Na2•2H2O 7.3g 用超純水定容至500ml
5.8 洗滌 5min × 3次
注：整個(gè)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中全部使用超純水,盡量減少離子的影響.
B實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配制
1.Bradford 工作液
95％乙醇 25ml 先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250,溶解完后再加磷
85％磷酸 52ml 酸,最后超純水定容至500ml.過濾后置于棕色瓶
考馬斯亮蘭G250 0.035g 外加油皮紙保存（Bradford不穩(wěn)定,一周內(nèi)有效）
2.裂解液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4％
DTT 60 mM
Tris—base 40 mM（如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5％的Pharmalate）
3. 水化液儲(chǔ)液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4％
Tris—base 40 mM
4. 分離膠buffer (pH8.8) 250ml
SDS 0.4％ 1g
Tris—HCl 1.5M 45.4275g
5. 濃縮膠buffer (pH6.8) 100ml
SDS 0.4％ 0.4g
Tris—HCl 0.5M 6.07g
6.凝膠儲(chǔ)存液（30％的丙烯酰胺） 250ml
Acr 29.2％ 73g
Bis 0.8％ 2g
7. 電極緩沖液（跑一次要配制2500ml）
甘氨酸 43.2g 36g
Tris 9g 或 7.5g
SDS 3g 2.5g
超純水定容至3000ml 超純水定容至2500ml
8.0.5M Tris —HCl pH 6.8儲(chǔ)液
6.1g Tris先用30ml超純水溶解,再用46ml,3M HCl調(diào)pH6.8,再加水定容至100ml
9.平衡液儲(chǔ)液
脲（即尿素） 36g
甘油 30％ 30ml
SDS 1％ 1g
0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超純水定容至100ml
10. 平衡液A（一根膠條）
DTT 20mg
平衡液儲(chǔ)液 10ml
11．平衡液B（一根膠條）
碘乙酰氨 300mg
平衡液儲(chǔ)液 10ml
0.05％溴酚蘭 15ul (平衡液A、B均需臨時(shí)配制)
12．0.5％瓊脂糖10ml
瓊脂糖 0.05g
電極緩沖液 10ml
溴酚蘭 25ul
補(bǔ)：4、5、6的溶液需過濾后儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆?
2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同,而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離.這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息.
二 實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 樣品的溶解
取純化后的晶體蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右,共處理一個(gè)小時(shí).其中每隔10～15分鐘振蕩一次,然后13200rpm離心15min除雜質(zhì),取上清分裝,每管70ul,—80oC保存.
2. Bradford法測(cè)蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測(cè)定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白含量.取 7個(gè)10ml的離心管,首先在5個(gè)離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分別加入2 ul的待測(cè)樣品溶液,再在每管中加入相應(yīng)體積的雙蒸水（總體積為80ul）,然后,各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的 Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用）,搖勻,2min在595nm下,按由低到高的濃度順序測(cè)定各濃度BSA的OD值,再測(cè)樣品 OD值.(測(cè)量過程要在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成).
3. 雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水）
3.1 水化液的制備
稱取2.0mg 的DTT,用700ul水化液儲(chǔ)液溶解后,加入8ul 0.05％ 的溴酚蘭,3.5ul（0.5％v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻,13200rpm離心15min 除雜質(zhì),取上清.在含300ug 蛋白（經(jīng)驗(yàn)值）的樣品溶解液中加入水化液,至終體積為340ul,振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì),取上清.
3.2 點(diǎn)樣,上膠
分兩次吸取樣品,每次170ul, 按從正極到負(fù)極的順序加入點(diǎn)樣槽兩側(cè),再用鑷子撥開Immobiline DryStrip gels (18cm,pH 3—10)膠條,從正極到負(fù)極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品.注意：膠條使用前,要在室溫中平衡30分鐘；加樣時(shí),正極要多加樣,以防氣泡的產(chǎn)生；壓膠時(shí)不能產(chǎn)生氣泡；酸性端對(duì)應(yīng)正極,堿性端對(duì)應(yīng)負(fù)極；樣品加好后,加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad),兩個(gè)上樣槽必須與底線齊平.
3.3 IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為20℃）
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共計(jì)44110vhs, 19.5小時(shí)
其中S1用于泡脹水化膠條,S2和S3用于去小離子,S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后,在濾紙上吸干（膠面,即接觸樣品那一面不能接觸濾紙,如果為18cm的膠條要將兩頭剪去）,再以超純水沖洗,濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略）,然后用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下,負(fù)極端（即堿性端）向上,放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端,酸性端留有溴 酚蘭作為標(biāo)記）,用平衡液A,平衡液B先后平衡15min. 注:平衡時(shí)要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁.
平衡第二次時(shí),在沸水中煮Marker 3min,剪兩個(gè)同樣大小的小紙片,長(zhǎng)度與一向膠條的寬度等同,然后吸取煮好的Marker,轉(zhuǎn)入SDS—PAGE膠面上,保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時(shí),煮5％的瓊脂糖10ml.
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE
4.1 配膠(兩根膠條所用劑量)
分離膠：（T=8％ 80 ml）：溶液于真空機(jī)中抽氣后再加APS和TEMED
30 ％ 丙烯酰胺儲(chǔ)液 21.28ml
分離膠buffer 20ml 10％APS 220ul TEMED 44 ul
雙蒸水 38.72ml
濃縮膠：（T=4.8％ 10ml）
30 ％ 丙烯酰胺儲(chǔ)液 1.6ml
濃縮膠buffer 2.5ml 10％APS 30ul TEMED 5ul
雙蒸水 5.9ml
4.2 灌膠
將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇?jí)耗z,凝膠后(這時(shí)會(huì)出現(xiàn)三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇?jí)耗z,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保鮮膜封好.
4.3 轉(zhuǎn)移
剪兩個(gè)小的濾紙片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE膠面的一端.然后,將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5％的瓊脂糖溶液在膠面 上(瓊脂糖凝膠在轉(zhuǎn)移前十幾分鐘的時(shí)候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態(tài),至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠 面,其中不斷補(bǔ)加5％的瓊脂糖溶液,注意不能產(chǎn)生氣泡.
4.4 跑膠
濃縮膠 13mA 分離膠 20mA 共約5.5個(gè)小時(shí)
5. 銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水）
5.1 固定 30min 無水乙醇 200ml+乙酸50ml,用超純水定容至500ml
5.2 敏化 30min 無水乙醇 150ml
Na2S2O3•5H2O 1.5688g
無水乙酸鈉 34g
先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml
5.3 洗滌 5min × 3次
5.4 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至500ml
5.5 洗滌 1min × 2次
5.6 顯影 無水Na2CO3 12.5g 用超純水定容至500ml
甲醛(37％)0.1ml, 臨時(shí)加
5.7 終止 10min EDTA—Na2•2H2O 7.3g 用超純水定容至500ml
5.8 洗滌 5min × 3次
注：整個(gè)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中全部使用超純水,盡量減少離子的影響.
B實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配制
1.Bradford 工作液
95％乙醇 25ml 先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250,溶解完后再加磷
85％磷酸 52ml 酸,最后超純水定容至500ml.過濾后置于棕色瓶
考馬斯亮蘭G250 0.035g 外加油皮紙保存（Bradford不穩(wěn)定,一周內(nèi)有效）
2.裂解液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4％
DTT 60 mM
Tris—base 40 mM（如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5％的Pharmalate）
3. 水化液儲(chǔ)液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4％
Tris—base 40 mM
4. 分離膠buffer (pH8.8) 250ml
SDS 0.4％ 1g
Tris—HCl 1.5M 45.4275g
5. 濃縮膠buffer (pH6.8) 100ml
SDS 0.4％ 0.4g
Tris—HCl 0.5M 6.07g
6.凝膠儲(chǔ)存液（30％的丙烯酰胺） 250ml
Acr 29.2％ 73g
Bis 0.8％ 2g
7. 電極緩沖液（跑一次要配制2500ml）
甘氨酸 43.2g 36g
Tris 9g 或 7.5g
SDS 3g 2.5g
超純水定容至3000ml 超純水定容至2500ml
8.0.5M Tris —HCl pH 6.8儲(chǔ)液
6.1g Tris先用30ml超純水溶解,再用46ml,3M HCl調(diào)pH6.8,再加水定容至100ml
9.平衡液儲(chǔ)液
脲（即尿素） 36g
甘油 30％ 30ml
SDS 1％ 1g
0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超純水定容至100ml
10. 平衡液A（一根膠條）
DTT 20mg
平衡液儲(chǔ)液 10ml
11．平衡液B（一根膠條）
碘乙酰氨 300mg
平衡液儲(chǔ)液 10ml
0.05％溴酚蘭 15ul (平衡液A、B均需臨時(shí)配制)
12．0.5％瓊脂糖10ml
瓊脂糖 0.05g
電極緩沖液 10ml
溴酚蘭 25ul
補(bǔ)：4、5、6的溶液需過濾后儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆?
