由于影響因素過多，細胞/組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的一些問題往往很難分析并得到解決，因此被人戲稱為“黑色藝術(shù)”或“巫術(shù)”。本文列舉了一些動物細胞/組織培養(yǎng)中常見的問題及解決方法。
1.培養(yǎng)試劑的保存：
血清：-5oC - -20oC 保存，避免反復凍融。
培養(yǎng)基: 2oC – 8oC避光保存。
完全培養(yǎng)基: 2oC – 8oC避光保存，并在2周內(nèi)用完。
盡量縮短血清和培養(yǎng)基見光的時間
2.液體培養(yǎng)基中谷氨酰胺使用方法：
很多細胞生長要求在培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應置于-20◦C冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4◦C 冰箱儲存兩周以上時，應重新加入原來量的谷氨酰胺。另一種選擇是使用L-谷氨酰胺的衍生物 - L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如啟維益成公司代理的GenDepot的產(chǎn)品Glutaplex配方中含有的成分之一） 替代L-谷氨酰胺。Glutaplex與L-谷氨酰胺相比更加穩(wěn)定，降解比較慢，提高細胞的存活和生長，極大降低對細胞有毒性的氨的積累。
3.培養(yǎng)基中是否應加酚紅：
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑，中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，特別是雌激素。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞尤其是哺乳類細胞時，應使用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時不使用加酚紅的培養(yǎng)基。
4.使用血清應注意的問題：
1）血清第一次使用前，是否應在56oC，30分鐘加熱血清以滅活補體系統(tǒng)？
激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞生長只有微小的促進或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率降低。而經(jīng)過熱處理的血清沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染。而把血清放在37℃環(huán)境中又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質(zhì)量。
2）通常使用的血清的種類：
新生牛血清：新出生牛5天內(nèi)取血制成。小牛血清：小牛出生16周以內(nèi)采血制成。胎牛血清：（進口血清）要求剖腹取胎制成。國內(nèi)廠家往往不能做到，經(jīng)常把出生2天以內(nèi)采血稱為胎牛血清。根據(jù)血清的生產(chǎn)工藝及血紅蛋白、內(nèi)毒素含量又分為：（1）特級胎牛血清：40納米過濾，內(nèi)毒素含量≤10EU， 血紅蛋白含量≤10mg/dl。（2）優(yōu)等胎牛血清：經(jīng)過3次100納米過濾，內(nèi)毒素含量≤25EU/ml，血紅蛋白含量≤25mg/ml。（3）標準胎牛血清：3次100納米過濾，低內(nèi)毒素，低血紅蛋白含量。
3）為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?
有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預老化，儲存在2-8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白，如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質(zhì)量。建議在-20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。
4）血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)：
血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成。而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后也會存在于血清中，也是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。
5）如何避免沉淀物的產(chǎn)生?
我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作: (1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-2℃至4℃過夜，37oC水浴解凍)。若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。(2)解凍血清時要隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。(4)如果在高于40oC的水浴中融化并且不時常搖晃混勻，非常容易造成沉淀物增多。同樣血清的熱滅活也造成沉淀增多，若非必要，可以省去熱滅活。(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。
5.培養(yǎng)用液pH對細胞生長的影響：
由于，大多數(shù)細胞培養(yǎng)適宜的pH為7.2-7.4，偏離此范圍對細胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)細胞一般對pH變動耐受力差，無限細胞系耐受力強。但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些，偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。因此，我們在配制培養(yǎng)用液時，可把液體的pH稍微調(diào)得偏酸一些。液體在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。
6.培養(yǎng)基pH變化迅速：
培養(yǎng)箱中CO2濃度不正確。碳酸氫鈉在培養(yǎng)液中濃度范圍為2.0 – 3.7g/L時，CO2的濃度范圍應分別為5% - 10%。
7.使用培養(yǎng)基時應注意的問題：
培養(yǎng)基在使用前需37oC預熱。 細胞培養(yǎng)過程中，吸取過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，防止殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)基焦化，將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中。盡量縮短各種液體、細胞的暴露時間，減少污染機會。避免液體間、細胞間的交叉污染。配制完全培養(yǎng)基時，配制的量最好在2周內(nèi)用完為好。
8.細胞傳代消化時胰蛋白酶的使用問題：
培養(yǎng)細胞胰蛋白酶溶液的消化能力和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg+離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力最強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。每次進行傳代消化前，一定要用無鈣鎂離子的PBS液或D-Hanks液反復沖洗細胞培養(yǎng)瓶，以便將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣可大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為： （1）０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ； （2）０.２５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ。多數(shù)細胞傳代消化可使用０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ這種消化液。
第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌管中，保存于–20℃，避免反復凍融造成胰蛋白酶活性降低，并可減少污染的機會。
注意：如果選用無血清培養(yǎng)基（如啟維益成公司代理的TNC Bio公司生產(chǎn)的產(chǎn)品 - 完全無動物成分的血清替代品XerumFreeTM與其他培養(yǎng)基混合配制的無血清培養(yǎng)基），在細胞傳代時，不可使用胰蛋白酶消化，因為胰蛋白酶在無血清時可去除細胞膜表面的受體，這種情況應使用AccutaseTM消化。
9.貼壁細胞在用蛋白酶消化時不易分離：
1）培養(yǎng)液中存在酶的抑制劑，可使用無鈣鎂離子的37oC預熱的Dulbecco’s PBS或胰酶-EDTA洗一遍，再消化
2）胰酶濃度太低，使用更高濃度的胰酶，更高濃度的EDTA或不同的酶消化，37oC消化以提高酶活性
3）細胞處于鋪滿狀態(tài)時間太長，形成細胞間的緊密連接，以后注意在細胞鋪滿之前進行繼代培養(yǎng)。
10.細胞分離后形成團塊：
1) 細胞分散過程太過分，如用力吹吸、酶濃度過高、消化時間過長或溫度過高，酶溶液有毒性（如緩沖液pH或滲透壓不正確等）以至基因組DNA從破裂的細胞中釋放出來。解決方法是在細胞懸液中加入1滴無菌的1mg/ml溶于水中的DNA酶。
2)去除上清時，細胞離心的強度太大或時間太長，應使用125g, 10分鐘輕微離心。
11.懸浮細胞形成團塊：
1）培養(yǎng)液中含有鈣鎂離子
2）支原體污染
3）由于過度消化造成細胞裂解，釋放出基因組DNA
12.細胞不貼壁：
1）消化時間過長，細胞膜上的貼壁蛋白被去除了
2）培養(yǎng)基中的血清或貼壁因子（常見于無血清培養(yǎng)基）不足，可在培養(yǎng)基中加入貼壁因子或使用膠原蛋白、多聚L賴氨酸、纖連蛋白等包被的培養(yǎng)瓶。
3）支原體污染
13.離心動物細胞的離心速率：
回收動物細胞，離心速率一般為300g，5 - 10 分鐘，離心強度過大將造成細胞破裂死亡。
14.細胞生長緩慢：
1）換用了不同的培養(yǎng)基或血清，解決方法是可比較不同培養(yǎng)基成分，用生長實驗比較以前批次和新批次的血清， 提高接種細胞數(shù)，使細胞逐步適應新的培養(yǎng)基 。
2）L-谷氨酸等促進細胞生長的成分沒加入，用盡或分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如啟維益成公司代理的GenDepot的產(chǎn)品Glutaplex）替代L-谷氨酸
3）支原體污染或低水平細菌或真菌污染
4）培養(yǎng)試劑保存不當
5）接種細胞數(shù)太少
6）細胞傳代次數(shù)太多
7）細胞傳代時密度太高，應在細胞鋪滿前的指數(shù)生長期傳代
15.細胞死亡：
1）培養(yǎng)箱中無CO2，檢查管子有無泄漏，是否需更換CO2罐，盡量減少開關(guān)培養(yǎng)箱的次數(shù)
2）培養(yǎng)箱溫度不恒定
3）抗真菌劑或抗生素濃度過高，對細胞產(chǎn)生毒性
4）細胞在凍存或解凍過程中被破壞
5）培養(yǎng)基中滲透壓不正確
6）培養(yǎng)基中積累了有毒的代謝產(chǎn)物
16.細胞冷凍培養(yǎng)基的成份：
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，所以不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。
17.DMSO的等級及使用和保存：
冷凍保存使用之DMSO 等級必須為Tissue culture grade的DMSO (如Sigma D2650)。其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4°C。避免反復凍融造成DMSO 裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質(zhì)濾膜。
18.凍存液中的甘油的保存：
要避光保存，見光后甘油轉(zhuǎn)化為對細胞有毒性的丙烯醛。
19.細胞欲冷凍保存時注意事項：
冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml為宜。實際操作時，建議按照細胞生產(chǎn)商建議的細胞密度凍存。凍存?zhèn)鞔螖?shù)低的細胞。
20.冷凍保存細胞之方法：
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30-60 分鐘→ （-20℃ 30 分鐘）→ -80℃16-18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase長期儲存，如細胞浸在液氮中，有可能被液氮中的微生物污染。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡。也可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，但存活率降低。
21.細胞解凍：
快速解凍，將37oC預熱的培養(yǎng)基逐滴加入解凍的細胞。
22.支原體污染、檢測及處理：
支原體污染在細胞培養(yǎng)中最常見、不易被查覺，但支原體污染可顯著影響細胞功能干擾實驗結(jié)果。支原體是介于細菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的最小微生物，它無細胞壁，形態(tài)呈高度多形性，最小直徑0.2um，可通過濾器。課題組從國外引進細胞株/系也經(jīng)常出現(xiàn)支原體的污染。支原體在污染細胞后，它通過影響細胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培養(yǎng)基中的氨基酸來抑制細胞的生長，并能降低細胞的融合率。因此，在運用各種細胞系進行實驗研究時，首先要證明所用細胞有無支原體的污染。支原體污染后，培養(yǎng)基可不發(fā)生渾濁，細胞病變輕微或不明顯，因此難以發(fā)現(xiàn)。
目前，支原體檢測的方法有以下幾種。（a）相差顯微鏡觀察；（b）低張?zhí)幚淼匾录t染色法； （c）熒光染色法；（d）酶標法； （e）PCR法：這是常用的一種簡便的檢測方法。 此方法靈敏度高，檢測耗時短，樣品量?。ㄖ恍?0ul細胞培養(yǎng)用液上清），但引物及制劑費用較高。
支原體污染的處理：1）丟棄細胞，培養(yǎng)基及其他培養(yǎng)用試劑 2）重新獲取未污染細胞，新鮮培養(yǎng)基和試劑。
