凋亡細(xì)胞的原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL法)
細(xì)胞凋亡的多步驟機(jī)制作用的最終環(huán)節(jié)是;細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì)DNA雙鏈的斷裂。大量DNA片段暴露出的3羥基在末斷轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)或DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助與卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合的熒光素或HRP，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來。
TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供
試劑1：酶濃縮溶液(EnzymeSolution)
試劑2：標(biāo)記溶液(LableSolution)
試劑3：轉(zhuǎn)化劑-POD(Converter-POD)
酶標(biāo)記抗熒光素抗體(即用型)
試驗(yàn)所需其它試劑：
非石蠟切片:
·沖洗緩沖液:磷酸鹽緩沖液(PBS)
·阻斷溶液:0.3%H2O2甲醇溶液
·固定溶液:4%多聚甲醛(溶劑pH7.4新鮮配制的PBS溶液)
·滲透液:0.1%Triton甔-100(溶于新鮮配制的0.1%枸櫞酸鈉溶液)
石蠟切片:
·二甲苯和乙醇(100%、95%、90%、80%、70%用蒸餾水稀釋)
·沖洗緩沖液:磷酸鹽緩沖液(PBS)
·蛋白酶K工作液10~20mg/ml溶于10mMTris/HCl(pH7.4~7.8)
根據(jù)需要選擇:
·滲透液:0.1%TritonX-100(溶于新鮮配制的0.1%枸櫞酸鈉溶液)
·胃酶溶液(0.25%-0.5%溶于HCl，pH2)或胰酶
·0.1M枸櫞酸緩沖液，pH6，微波修復(fù)
材料：微波爐，微波輸出功率850W-2000W2.選用中性甲醇固定的活檢及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。
操作步驟
抗原微波修復(fù)(供參考)
1.組織經(jīng)福爾馬林固定后會(huì)產(chǎn)生廣泛的蛋白質(zhì)交連，因此石蠟組織進(jìn)行凋亡檢測時(shí)要進(jìn)行預(yù)處理。經(jīng)我公司科研人員的長期研究認(rèn)為：TUNEL染色時(shí)蛋白酶K的作用有可能引起內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的釋放，造成假陽性反應(yīng)，同時(shí)過量的蛋白酶K處理可破壞組織的結(jié)構(gòu)，用微波技術(shù)替代上述處理可避免上述弊端的出現(xiàn)。
2.微波已被愈來愈多地作為免疫組織化學(xué)和原位雜交的預(yù)處理過程，經(jīng)一定溫度的微波處理可修復(fù)因固定和包埋造成的抗原破壞，打斷氨基酸的肽鍵結(jié)合，促進(jìn)抗原決定簇的暴露，恢復(fù)細(xì)胞膜的空間結(jié)構(gòu)，增加穿透效應(yīng)，加速組織處理及染色過程。我們在作TUNEL染色前進(jìn)行微波修復(fù)，可以達(dá)到蛋白酶K的功效，取得較為理想的效果，背景染色很淺，凋亡細(xì)胞陽性顆粒與背景染色對比非常鮮明。
3.蛋白酶K作用的條件嚴(yán)格，消化度常因組織的不同而在操作中不便掌握。同時(shí)蛋白酶K的價(jià)格昂貴，而微波已作為一種常用儀器用于免疫組織化學(xué)染色中。
(1)切片常規(guī)脫蠟入水
(2)將一燒杯盛200ml的0.01M、pH6.0的檸檬酸緩沖液，加熱至90～95℃，迅速放入切片，使用680W(80%功率)、微波照射1min，加入雙蒸水(20～25℃)80ml作迅速冷卻，將玻片移至PBS(20～25℃)。(3)PBS洗5min×3次。
(4)加20%正常牛血清室溫30min。
(5)將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上，37℃溫育90min(陰性對照片、TUNEL混合液中不加TDT)。
(6)PBS洗5min×3次。
(7)3%H2O2甲醇液室溫阻斷10min。
(8)37℃溫育90min。
(9)加POD轉(zhuǎn)化劑，37℃溫育30min。
(10)PBS洗5min×3次。
(11)DAB/H2O2顯色。
(12)蘇木素淡染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。
結(jié)果：細(xì)胞核呈棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，結(jié)合形態(tài)特征，可確立凋亡細(xì)胞。陰性對照片無棕色顆粒。
細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù)簡介(供參考)
一.凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變
細(xì)胞表面：偽足,微絨毛等消失
細(xì)胞體形態(tài)：細(xì)胞皺縮，變形，體積變小
細(xì)胞核：染色質(zhì)濃縮，早期染色質(zhì)聚集于核膜邊呈新月形或環(huán)形，晚期碎裂
細(xì)胞器：密集但形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴(kuò)張細(xì)胞膜:完好，晚期包裹細(xì)胞器或核碎片，形成凋亡小體
在組織中表現(xiàn)：常常以單個(gè)細(xì)胞散在
發(fā)生周圍組織反應(yīng)：凋亡細(xì)胞或小體被鄰近巨噬細(xì)胞，上皮細(xì)胞吞噬，降解，不發(fā)生炎癥反應(yīng)
發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細(xì)胞死亡，多發(fā)生于器官萎縮，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷機(jī)制，小劑量毒素作用以及多種病理生理狀態(tài)
二.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測方法
(一)凋亡細(xì)胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測
1.制片
(1)常規(guī)組織學(xué)切片，進(jìn)行脫蠟和水化。
(2)培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞離心儀制片。由于凋亡細(xì)胞在制片中容易破碎,所以應(yīng)采用低速離心制片(250g,離心5min)，并事先將載玻片用1%BSA處理，使細(xì)胞易于貼附.離心后涂片,稍經(jīng)空氣中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4℃下固定15-30min，然后轉(zhuǎn)入80%乙醇后固定1-2h，保存于-20℃待用.
2.染色方法
可用多種方法進(jìn)行染色。
(1)可采用常規(guī)的組織學(xué)染色方法，如Giemsa染色，HE染色或Mayer蘇木素染色.
(2)采用熒光染料染色，如DAPI(4′,6′-diamidino-2-phenylindole),PI(propidiumiodide)和7-AAD(7-aminoacetinomycinD).其染色濃度為:DAPI1-2μg/ml;PI5-10μg/ml;7-AAD10-20μg/ml.由于PI染料同時(shí)也與RNA結(jié)合,所以應(yīng)將細(xì)胞先用RNA酶消化(50Kunitz單位的RNA酶,37℃下作用15min或室溫下30min)后,再進(jìn)行PI染色。
3.結(jié)果觀察
典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞體積縮小及變形;核濃染及喪失亞形態(tài)結(jié)構(gòu)，可見核染色質(zhì)呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片;在組織切片上可見巨噬細(xì)胞或鄰近的上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞或凋亡小體。
TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒內(nèi)容及操作步驟
(二)凋亡細(xì)胞的電鏡觀察
采用電鏡的常規(guī)方法固定，包埋和制片。可用透射電鏡或掃描電鏡進(jìn)行觀察。透射電鏡下，凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，核膜消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，而細(xì)胞器如線粒體等形態(tài)仍保持良好，可見被膜結(jié)構(gòu)包繞的細(xì)胞器，即凋亡小體。掃描電鏡下，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)如偽足，微絨毛等消失，細(xì)胞膜呈現(xiàn)波浪狀起伏。
