一、實驗背景
1、目的：建立地榆中金絲桃苷的高效液相色譜含量測定方法。
2、方法：采用RP-HPLC測定，C18柱，流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54)，用三乙胺調(diào)pH至3.0，流速1.0ml·min-1，檢測波長370nm；供試品溶液的制備采用甲醇超聲提取。
3、結(jié)果：測定了不同產(chǎn)地不同批次的地榆藥材，金絲桃苷質(zhì)量分數(shù)在0.052%～0.291%。結(jié)論該方法靈敏快速，準確可靠，可用于地榆的質(zhì)量控制。
4、意義：地榆為薔薇科植物地榆或長葉地榆的干燥根。其味苦、酸、澀，微寒，具有涼血止血、解毒斂瘡之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，主要有效成分為黃酮類化合物，但藥典記載質(zhì)量標準的定量檢測方法僅為紫外-可見分光光度法測定其鞣質(zhì)含量，該法操作繁瑣。金絲桃苷為地榆藥材中提取得到的黃酮類化合物。研究表明，地榆中的金絲桃苷是其止痛作用的有效成分之一。本實驗采用RP-HPLC法對不同產(chǎn)地中藥材市場商品地榆的金絲桃苷成分進行了定量分析，考察了流通商品地榆的質(zhì)量狀況，為進一步提高地榆藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。
二、儀器與試藥
1、高效液相色譜儀，含在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、智能柱溫箱、紫外可見光檢測器(VWD)、化學(xué)工作站。超聲波清洗器。
2、地榆的干燥根或飲片。實驗中將樣品粉碎后過100目篩，置干燥器中備用。
3、金絲桃苷(111521-200303，國藥品生物制品檢定所,供含量測定用)。甲醇為色譜純，實驗用水為Milli-Q超純水。其他試劑均為分析純。
三、方法與結(jié)果
1、對照品溶液的制備
精密稱取金絲桃苷13.25mg，置量瓶中，加甲醇定容至25ml，其金絲桃苷含量為0.53mg·ml-1。再精密吸取金絲桃苷對照品溶液2.0ml，加甲醇定容至50ml量瓶中，其金絲桃苷含量為0.0212mg·ml-1。
2、供試品溶液的制備
取地榆干燥藥材或飲片的粉末(過100目)1g，分別精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100ml，稱定重量，超聲提取1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，用續(xù)濾液作為供試品溶液。
3、色譜條件
HypersilODS2分析柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相甲醇-0.2%磷酸溶液(46：54)，用三乙胺調(diào)pH至3.0；流速1.0ml·min-1；檢測波長370nm；柱溫25℃；進樣量10μl；在選定的色譜條件下，色譜柱的分離效率(簡稱柱效)>理論塔板數(shù)以金絲桃苷峰計算不低于3000。分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。
4、檢測波長的選擇
取金絲桃苷對照品適量，用甲醇溶解后作紫外全波長掃描，λ286，370nm,因286nm下非黃酮物質(zhì)也有吸收，為避免干擾，選擇檢測波長為370nm。
5、線性關(guān)系的考察
分別精密吸取0.0212mg·ml-1的金絲桃苷對照品溶液2，4，6，8，10，12，16μl注入液相色譜儀，測定基線構(gòu)成之面積稱峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064Wh/2h>峰面積，以金絲桃苷含量(X)為橫坐標，其峰面積吸收度積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為：Y=2263.9X 2.9635，r=0.9998(n=7)，表明金絲桃苷在0.04～0.34μg線性關(guān)系良好。
6、精密度實驗
精密吸取0.0212mg·ml-1金絲桃苷對照品溶液10μl，連續(xù)進樣5次，測得峰面積積分值RSD為0.86%，表明精密度良好。
7、重復(fù)性實驗
精密稱取同一樣品粉末1g(5份)，按供試品溶液的制備方法制備，進樣10μl，測得金絲桃苷含量的RSD為0.99%，表明該方法的重復(fù)性好。
8、穩(wěn)定性實驗同一供試品溶液，從制備完畢開始放置，分別于0，2，4，6，8，10h進樣檢測，其峰面積積分值RSD為1.9%。表明供試品溶液在10h內(nèi)比較穩(wěn)定。
9、加樣回收率實驗
取已知含量的藥材(6號含量1.60mg·g-1)樣品6份，每份0.50g，精密稱定，計算樣品中金絲桃苷量，分別加入適量的金絲桃苷對照品，按樣品制備方法和測試條件進行測定，計算加樣回收率。
10、樣品測定
分別精密吸取各樣品10μl進樣測定，計算含量。
四、實驗結(jié)果討論
1、提取條件的選擇
根據(jù)金絲桃苷的溶解性能，選擇乙醇、甲醇、醋酸乙酯作為提取溶劑，比較了3種提取溶劑提取方法(超聲、回流及索氏提取)和不同提取時間(0.5，1.0，1.5h)對提取效果的影響。結(jié)果顯示采用超聲提取方法的提取率最高，甲醇提取效果最好，含量結(jié)果表明超聲提取1.0h可使待測成分提取完全。實驗證實，含量并未隨著提取時間延長而有所增加，超過1h時含量甚至有下降的趨勢。
2、流動相的選擇
由于金絲桃苷為黃酮類化合物，本實驗采用甲醇和0.2%磷酸溶液的二元流動相體系，但實驗中發(fā)現(xiàn)拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。>色譜峰有拖尾現(xiàn)象。經(jīng)反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，在1000ml的0.2%磷酸溶液中加入1.8ml三乙胺時的分離效果最佳，經(jīng)多次，多批樣品測試，系統(tǒng)具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，三乙胺能與ODS柱中鍵合相的殘余硅醇基相互作用，提高分離度，有助于改善峰形。因此以甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54)用三乙胺調(diào)pH至3.0為優(yōu)，分離效果較好，保留時間適中，且無干擾［3］。本方法操作簡便、快速、重復(fù)性好，適用于地榆中金絲桃苷含量的測定。
3、樣品分析
對不同產(chǎn)地地榆中的金絲桃苷含量進行了測定，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地金絲桃苷的含量存在著一定的差異，有必要對其進行質(zhì)量控制。
