由于國(guó)內(nèi)食品安全問(wèn)題種類(lèi)繁多，本文挑選目前關(guān)注度較高且風(fēng)險(xiǎn)較高的微生物污染進(jìn)行分析，并將微生物污染分為3類(lèi)，即細(xì)菌污染、真菌污染和病毒污染。筆者剖析以上3種微生物污染的危害及對(duì)食品行業(yè)和消費(fèi)者的影響，介紹主流食源性致病菌微生物檢測(cè)技術(shù)，包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)及現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)等多種檢測(cè)方法，并分析各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如傳統(tǒng)的培養(yǎng)基方法、測(cè)試片方法、顯微鏡檢測(cè)法、分子生物學(xué)方法、酶聯(lián)免疫法及ATP生物熒光法等經(jīng)典方法，以期為廣大食品檢測(cè)者提供選擇參考性依據(jù)。
食品安全是全球廣泛關(guān)注的問(wèn)題，近年來(lái)我國(guó)也屢屢發(fā)生因食品污染引發(fā)的食物中毒事件，而2008年的三鹿奶粉事件更加促使人們對(duì)食品安全的進(jìn)一步關(guān)注。有統(tǒng)計(jì)顯示，在影響中國(guó)食品安全的諸多因素中，微生物污染高居首位。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)在我國(guó)發(fā)生的食物中毒事件中，微生物食物中毒居各類(lèi)食物中毒病原的首位，是威脅中國(guó)食品安全的頭號(hào)殺手。
1、微生物污染的特點(diǎn)及其危害性
食品的微生物污染通常由一些致病微生物引起，主要包括細(xì)菌、真菌和病毒3類(lèi)。由于微生物具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，食品原料在種植、收獲、飼養(yǎng)、捕撈、加工、包裝、運(yùn)輸、銷(xiāo)售、保存及食用等眾多環(huán)節(jié)都可能被微生物污染。同時(shí)，微生物具有易變異性，未來(lái)可能不斷有新的病原微生物威脅食品安全和人類(lèi)健康。相較于其他化學(xué)污染來(lái)說(shuō)，食品易受微生物污染的特點(diǎn)是與生俱來(lái)的，由于微生物在空氣、水、人體等環(huán)境中無(wú)所不在，這使其成為食品加工過(guò)程中無(wú)法杜絕污染的因素之一。可以說(shuō)，現(xiàn)代食品安全管理中，微生物污染是頭等大事，食品生產(chǎn)者必須足夠重視，才有可能將其危害控制在安全水平之下。
1.1 細(xì)菌性污染
細(xì)菌性污染是涉及面最廣、影響最大、問(wèn)題最多的一類(lèi)食品污染，其引起的食物中毒在所有食物中毒中具有普遍性并極具爆發(fā)性。細(xì)菌性食物中毒全年皆可發(fā)生，具有易發(fā)性和普遍性等特點(diǎn)，對(duì)人類(lèi)健康有較大的威脅。
引起食品污染的微生物主要有沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌(Bibrio parahemolyticus)、志賀菌(Shigella)、葡萄球菌等。近年來(lái)，變形菌屬、李斯特菌(Listeria)、大腸菌科、弧菌屬(Vibrio)引起的食品污染呈上升趨勢(shì)：美國(guó)1999年沙門(mén)氏菌發(fā)病1400萬(wàn)例，住院16430人，死亡582人，損失達(dá)23億美元，其中96%的患者由于攝入受污染食物而被感染;1992年印度爆發(fā)霍亂弧菌(Vibrio comma)O139中毒事件，波及孟加拉、巴基斯坦等許多國(guó)家;1996年5~8月，日本爆發(fā)大腸桿菌O157中毒事件，中毒人數(shù)過(guò)萬(wàn)，死亡11人;1999年在美國(guó)、2000年在法國(guó)也發(fā)生過(guò)李斯特菌中毒事件……根據(jù)美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)統(tǒng)計(jì)，2000~2005年，美國(guó)共有470人因飲用生牛奶而感染埃希氏大腸桿菌，總共發(fā)生中毒事件18起，涉及16個(gè)州。我國(guó)食品的細(xì)菌性污染現(xiàn)象也非常普遍，其主要是由蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、副溶血性弧菌和沙門(mén)氏菌等微生物引起的食物中毒事件。
1.2 真菌性污染
真菌在發(fā)酵食品行業(yè)的應(yīng)用非常廣泛，但許多真菌也會(huì)產(chǎn)生真菌毒素，從而引起食品污染。尤其是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)致癌性的黃曲霉素以來(lái)，真菌與真菌毒素對(duì)食品的污染日益引起各方重視。真菌毒素不僅具有較強(qiáng)的急性毒性和慢性毒性，還具有致癌、致畸、致突變性，如黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的黃曲霉素，麥角菌(Claviceps purpurea)產(chǎn)生的麥角堿，以及雜色曲霉(Aspergillus versicolor)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)產(chǎn)生的雜色曲霉素等。真菌毒素的毒性可以分為神經(jīng)毒、肝臟毒、腎臟毒、細(xì)胞毒等，如黃曲霉素具有強(qiáng)烈的肝臟毒，可以引起肝癌。
常見(jiàn)的產(chǎn)毒真菌主要有曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、鐮刀菌(Fusarium)、交鏈孢霉(Alternaria)等。由于真菌生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)生毒素需要一定的溫度與濕度，因此真菌性食物中毒往往有較為明顯的季節(jié)性和地區(qū)性。在我國(guó)北方地區(qū)食品中黃曲霉素B1污染較輕，而長(zhǎng)江沿岸和長(zhǎng)江以南地區(qū)則較重。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肝癌等癌癥的發(fā)病率與當(dāng)?shù)氐募Z食霉變現(xiàn)象有一定關(guān)系。
1.3 病毒性污染
與細(xì)菌、真菌不同，病毒的繁殖離不開(kāi)宿主，所以病毒往往先污染動(dòng)物性食品，然后通過(guò)宿主、食物等媒介進(jìn)一步傳播。帶有病毒的水產(chǎn)品、患病動(dòng)物的乳/肉制品一般是病毒性食物中毒的起源。同細(xì)菌、真菌引起的病變相比，食源性病毒引發(fā)的疾病更加難以得到有效治療，且更容易爆發(fā)流行。
常見(jiàn)食源性病毒主要有甲型肝炎病毒(HepatitisA)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E)、輪狀病毒(Rotavirus)、諾瓦克病毒(Norwalk)、朊病毒(Prion)、禽流感病毒(Avian influenza)等，這些病毒曾經(jīng)或仍在肆虐，造成了許多重大的疾病群發(fā)事件。1988年初，上海市區(qū)居民因食用被甲型肝炎病毒污染的毛蚶(Scapharca subcrenata)而導(dǎo)致甲型肝炎爆發(fā)流行，發(fā)病人數(shù)達(dá)30萬(wàn);由朊病毒引起的瘋牛病于1986年首先在英國(guó)被確認(rèn)，迄今為止，全球共有100余人死于這一病癥，據(jù)估計(jì)，西歐已有50萬(wàn)人被瘋牛病病毒所感染;自H5N1型高致病性禽流感病毒引起的禽流感疫情爆發(fā)以來(lái)，全球各地不乏有死亡病例報(bào)道;美國(guó)目前每年約有2300萬(wàn)例諾瓦克(諾如)病毒性胃腸炎。
2 食品中微生物的檢測(cè)技術(shù)及其趨勢(shì)
2.1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法
2.1.1 瓊脂平板培養(yǎng)法
因培養(yǎng)基不同，瓊脂平板法分為選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)法和顯色培養(yǎng)基檢測(cè)法。選擇性培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制劑來(lái)抑制非目標(biāo)微生物生長(zhǎng);顯色培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入細(xì)菌特異性酶的顯色底物，以菌落顏色區(qū)分目的菌落與非目的菌落。
2.1.2 顯微鏡鏡檢法
將待測(cè)樣品中的微生物富集后，于油鏡下直接計(jì)數(shù)。顯微鏡鏡檢法通常與瓊脂平板培養(yǎng)法結(jié)合使用，通過(guò)瓊脂平板培養(yǎng)法對(duì)菌落進(jìn)行定性分析，再用顯微鏡進(jìn)行定量計(jì)數(shù)。傳統(tǒng)檢測(cè)方法雖然對(duì)設(shè)備要求不高，技術(shù)含量也偏低，但耗時(shí)長(zhǎng)，人工消耗量大，一般檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況合理挑選檢測(cè)方法，無(wú)需拘泥于方法選擇的形式。
2.1.3 微生物測(cè)試片檢測(cè)技術(shù)
一般情況下，微生物測(cè)試片由印有網(wǎng)格的聚丙烯薄膜和覆蓋有培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)的聚乙烯薄膜組成。待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)處理后可直接接種在微生物測(cè)試片上，然后放置在適宜的溫度下培養(yǎng)——使固定在測(cè)試片上的顯色物質(zhì)與待檢微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生的特異性酶發(fā)生顯色反應(yīng)，形成有顏色的菌落，通過(guò)對(duì)這些菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)便可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。測(cè)試片法菌落典型，易于判讀，且因其操作簡(jiǎn)便、計(jì)數(shù)直觀，多數(shù)可縮短培養(yǎng)周期從而快速得到結(jié)果，而且人為操作環(huán)節(jié)較少，商品化程度高，避免了因人為因素造成誤差較大的缺點(diǎn)。
測(cè)試片法是最為成熟的食源性微生物快速檢測(cè)方法之一。對(duì)于一些熱敏感的細(xì)菌，由于測(cè)試片在整個(gè)操作過(guò)程中均處于常溫環(huán)境，可有效避免熱損傷，因此能夠提供更加精準(zhǔn)的計(jì)數(shù)結(jié)果。目前，市場(chǎng)上較為成熟的系列微生物測(cè)試片主要生產(chǎn)廠家包括美國(guó)3M公司、德國(guó)默克公司、北京陸橋公司、北京良潤(rùn)生物科技有限公司等，該測(cè)試片可分別檢測(cè)菌落總數(shù)、大腸菌群及大腸桿菌計(jì)數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)、腸桿菌科計(jì)數(shù)、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌等，且微生物測(cè)試片與傳統(tǒng)檢測(cè)方法之間的相關(guān)性非常好，均可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異。目前，因其快速簡(jiǎn)便的特性，故已廣泛應(yīng)用于我國(guó)食品行業(yè)和環(huán)境、過(guò)程及成品的檢測(cè)。但是，由于我國(guó)國(guó)標(biāo)的現(xiàn)狀——檢測(cè)方法為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，所以目前該方法僅用于工廠內(nèi)控。在此，基于行業(yè)需求特點(diǎn)，筆者也呼吁將來(lái)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)可以進(jìn)行改進(jìn)，增加更多簡(jiǎn)便等效性方法，以方便更多的檢測(cè)行業(yè)可以根據(jù)自身特點(diǎn)靈活應(yīng)用微生物檢測(cè)方法。
2.2 現(xiàn)代檢測(cè)方法
2.2.1 分子生物學(xué)檢測(cè)方法
目前，市場(chǎng)上對(duì)突發(fā)感染性或傳染性疫情溯源及預(yù)警的需求越來(lái)越多，傳統(tǒng)的分型技術(shù)因分辨能力有限，已無(wú)法滿足以上需求，因此促進(jìn)了基因分型技術(shù)的產(chǎn)生——從分子生物水平上研究生物大分子，包括核酸結(jié)構(gòu)及其組成成分?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展起來(lái)的基因分型技術(shù)大致分為兩類(lèi)，即非PCR技術(shù)和PCR的技術(shù)。最初的非PCR基因分型技術(shù)是酶切和雜交方法，需要預(yù)知基因組信息，費(fèi)用巨大，對(duì)操作人員的技術(shù)要求也相對(duì)較高。PCR技術(shù)的發(fā)明為食源性病原微生物的檢測(cè)提供了非常有力的手段，如環(huán)介導(dǎo)等溫核算擴(kuò)增。該方法近年來(lái)被食品工業(yè)用戶較多地用于致病菌快速檢測(cè)，其操作簡(jiǎn)便、增菌時(shí)間短、擴(kuò)增時(shí)效快且結(jié)果準(zhǔn)確，但不足之處在于工業(yè)用戶對(duì)實(shí)驗(yàn)室布局把控尚需改進(jìn)，避免交叉污染帶來(lái)的假陽(yáng)性上作改進(jìn)?；蚍中图夹g(shù)不但為細(xì)菌傳播動(dòng)力學(xué)提供許多重要的結(jié)論，而且為進(jìn)一步研究細(xì)菌種系發(fā)生特征提供了新的途徑。
2.2.2 ATP生物發(fā)光法
ATP生物發(fā)光法的基本原理是基于死/活菌的ATP含量差別。活的菌體中ATP含量恒定，而菌體死亡后，由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用，菌體中的ATP將迅速被分解，因此可以通過(guò)測(cè)定待測(cè)菌體中ATP的濃度從而計(jì)算出活菌數(shù)。與傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法相比，ATP生物發(fā)光法檢測(cè)食源性微生物時(shí)更簡(jiǎn)便靈敏、快速高效，并且相關(guān)儀器的開(kāi)發(fā)應(yīng)用也能同時(shí)發(fā)展起來(lái)，例如液閃計(jì)數(shù)器、照度計(jì)等小型化的測(cè)試儀器非常便于攜帶,適合在現(xiàn)場(chǎng)對(duì)食品衛(wèi)生進(jìn)行檢測(cè)，可以說(shuō)是目前檢測(cè)微生物數(shù)目最快捷的方法之一，因此被廣泛應(yīng)用于微生物檢驗(yàn)和食品生產(chǎn)環(huán)境清潔度的檢測(cè)。ATP生物發(fā)光法的缺點(diǎn)在于其易受到鹽分及其他化學(xué)物質(zhì)、游離態(tài)等非目標(biāo)的干擾，若忽略這些干擾因素，必然會(huì)使檢測(cè)結(jié)果受到影響，而且此方法不能區(qū)分微生物與非微生物ATP。近年來(lái)，基于ATP技術(shù)原理，許多儀器生產(chǎn)廠家提供了大量解決方案用于商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)，經(jīng)較短于傳統(tǒng)方法報(bào)文后，將食品基質(zhì)內(nèi)的ATP進(jìn)行講解，釋放微生物胞內(nèi)ATP，并用儀器進(jìn)行檢測(cè)后，從而達(dá)到商業(yè)無(wú)菌快速檢測(cè)，為廣大乳品、飲料企業(yè)所歡迎的商業(yè)無(wú)菌快速檢測(cè)方法。
2.2.3 酶聯(lián)免疫技術(shù)
最初的免疫酶測(cè)定是使酶與抗體或抗原結(jié)合以檢查組織中相應(yīng)的抗原或抗體的存在。經(jīng)過(guò)優(yōu)化發(fā)展，其逐步演變成目前應(yīng)用較廣的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)——首先用固相載體將抗原或抗體吸附，然后在載體上對(duì)免疫酶進(jìn)行染色，一段時(shí)間后用肉眼或分光光度計(jì)進(jìn)行結(jié)果判定分析。酶是一種極為敏感的有機(jī)催化劑，少量的酶便可催化大量的反應(yīng)，其在與抗體或抗原結(jié)合的情況下仍可保持酶本身的生物活性，且不改變抗體或抗原的特性，反應(yīng)后的有色產(chǎn)物可用肉眼定性觀察及用酶標(biāo)儀等光學(xué)儀器進(jìn)行精準(zhǔn)定量檢測(cè)。
3. 結(jié)語(yǔ)
綜上所述，由于食品中微生物污染的不可避免性，食品從業(yè)者應(yīng)該重視食品微生物污染，并掌握精準(zhǔn)的檢測(cè)方法選擇最適合自身需求的方法，從而快速準(zhǔn)確的找到目標(biāo)微生物，完成檢測(cè)的目的，準(zhǔn)確掌握食品微生物污染的情況。因此，進(jìn)一步分析污染源頭，并找出最佳的合理的預(yù)防措施，方能實(shí)現(xiàn)食品中微生物污染監(jiān)控的目的，為食品安全保駕護(hù)航。
