蠟樣芽胞桿菌及檢驗

4、耐熱性

　　蠟桿芽胞桿菌耐熱，其37℃16小時的肉湯培養(yǎng)物的D80℃值（在80℃時使細(xì)菌數(shù)減少90%所需的時間）約為10-15分鐘；使肉湯中細(xì)菌（2.4×10⁷/mL）轉(zhuǎn)為陰性需100℃20分鐘。其游離芽胞能耐受100℃30分鐘，而干熱滅菌需120℃60分鐘才能殺死。

二、流行病學(xué)

1、細(xì)菌分布

　　蠟樣芽胞桿菌在自然界分布廣泛，常存在于土壤、灰塵和污水中，植物和許多生熟食品中常見。已從多種食品中分離出該菌，包括肉、乳制品、蔬菜、魚、土豆、糊、醬油、布丁、炒米飯以及各種甜點等。

　　在美國，炒米飯是引發(fā)蠟樣芽胞桿菌嘔吐型食物中毒的主要原因；在歐洲大都由甜點、肉餅、色拉和奶、肉類食品引起；在我國主要與受污染的米飯或淀粉類制品有關(guān)。

2、流行情況

　　蠟樣芽胞桿菌作為一種食源性疾病的報導(dǎo)較多，在各種食品中的檢出率也較高，如1982年犬飼等對日本名古屋所采1641份食品樣品中，有193份檢出了該菌、陽性率為11.8%；1984年我國有關(guān)單位對南京市所采211份食品樣品中，有81份檢出了該菌，陽性率為38.4%。

　　蠟樣芽胞桿菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存溫度不當(dāng)，放置時間較長或食品經(jīng)加熱而殘存的芽胞以生長繁殖的條件，因而導(dǎo)致中毒。中毒的發(fā)病率較高，一般為60-100%。但也有在可疑食品中找不到蠟樣芽胞桿菌而引起食物中毒的情況，一般認(rèn)為是由于蠟桿芽胞桿菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定毒素所致。1985年9月，美國緬因州的健康局報導(dǎo)了在一家日本餐館發(fā)生了食物中毒而導(dǎo)致的胃腸炎事件，經(jīng)調(diào)查所有的食品其加工和儲藏都是規(guī)范的，僅用剩飯制作的炒飯其是冷藏儲放還是在室溫放置說不清楚，在炒飯中雖然找不到活的蠟樣芽胞桿菌，但是完全可能存在重新加熱過程中消除了活菌而沒有破壞熱穩(wěn)定毒素的可能性。

3、臨床癥狀

　　當(dāng)攝入的食品其蠟樣芽胞桿菌數(shù)量達(dá)>10⁶/克時?？蓪?dǎo)致食物中毒。

　　蠟樣芽胞桿菌食物中毒在臨床上可分為嘔吐型和腹瀉型兩類。嘔吐型的潛伏期為0.5-6小時，中毒癥狀以惡心、嘔吐為主，偶而有腹痙攣或腹瀉等癥狀，病程不超過24小時，這種類型的癥狀類似于由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒。腹瀉型的潛伏期為6-15小時，癥狀以水瀉、腹痙攣、腹痛為主，有時會有惡心等癥狀，病程約24小時，這種類型的癥狀類似于產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒。

三、致病性

　　蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒是由于該菌產(chǎn)生腸毒素。它產(chǎn)生兩種性質(zhì)不同的代謝物，引起腹瀉型綜合癥的是一種大分子量蛋白；而引起嘔吐型綜合癥的被認(rèn)為是一種小分子量、熱穩(wěn)定的多肽。

　　致嘔吐型綜合癥的腸毒素至今尚未提純，致腹瀉型綜合癥的腸毒素已提純，其純化的腸毒素分子量為55-6.0×10³。致腹瀉的腸毒素能使小白鼠致死。

表2：蠟樣芽胞桿菌腹瀉和嘔吐毒素的性狀

四、檢驗和控制

A、樣品制備

　　無菌操作稱取樣品50g放入滅菌攪拌缸內(nèi)。加Butterfield�s磷酸鹽緩沖稀釋液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均質(zhì)2min。用上述1:10稀釋液，連續(xù)稀釋供蠟樣芽胞桿菌計數(shù)。

B、蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)

　　移取10mL均質(zhì)樣液（1:10稀釋）加到90mL空白液中，從10^-2到10^-6制備一系列稀釋液，充分混勻，并繼續(xù)稀釋直到10^-6為止。取樣品的各個稀釋液（包括1:10）0.1mL接種2只MYP（甘露醇一卵黃多粘菌素瓊脂）平板，用滅菌玻璃棒在每只平板表面涂布均勻。將平板置30℃培養(yǎng)24小時，并檢查菌落周圍有沉淀圈者，表示產(chǎn)生卵磷脂酶。蠟樣芽胞桿菌菌落通常是粉紅色，隨著培養(yǎng)時間的延長則更明顯。如果上述反應(yīng)不清晰，應(yīng)將平板再培養(yǎng)24小時后計數(shù)，從MYP平板上挑取典型菌落5個或更多，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上供蠟樣芽胞桿菌證實試驗用。

C、蠟樣芽胞桿菌的最大近似數(shù)

　　MPN技術(shù)被推薦用于食品中低于10個/g蠟樣芽胞桿菌的檢驗。某些不適合用平板計數(shù)法的脫水淀粉類食品也可用此法檢驗。

　　在胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中接種3管MPN系列，10^-1、10^-2、10^-3的稀釋液各接種1mL于3管。將培養(yǎng)管置30℃培養(yǎng)48±2小時，檢查生長密集、典型的蠟樣芽胞桿菌。將陽性管培養(yǎng)物劃線接種于MYP平板，于30℃培養(yǎng)24-48小時。以下步驟同B。

D、蠟樣芽胞桿菌的證實試驗

　　從MYP瓊脂平板上挑取5個或更多的伊紅粉色，卵磷脂酶陽性的菌落，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，置30℃培養(yǎng)24小時。取培養(yǎng)物作了革蘭氏染色和顯微鏡觀察。再用3mm直徑的接種環(huán)取培養(yǎng)物到裝有0.5mL滅菌磷酸緩沖稀釋液的13×100mm試管中，充分混懸均勻。用于下列試驗。

·酚紅葡萄糖肉湯

·硝酸鹽肉湯

·改良的V-P培養(yǎng)基

·酪氨酸瓊脂

·溶菌酶肉湯

·MYP瓊脂

　　蠟樣芽胞桿菌的分離物應(yīng)符合下述條件。

1)革蘭氏陽性產(chǎn)芽胞大桿菌，其芽胞不突出體外；

2）在MYP瓊脂上產(chǎn)生卵磷脂酶而不發(fā)酵甘露醇；

3）厭氧培養(yǎng)生長，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸；

4）還原硝酸鹽；

5）VP陽性；

6）分介L-酪氨酸；

7）在含0.001%溶菌酶的培養(yǎng)基中能生長。

E、蠟樣芽胞桿菌群的鑒別試驗

　　從表1可見D部分所述的生化特性為蠟樣芽胞桿菌群所共有。要鑒別典型蠟樣芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌群的其它種還需進(jìn)一步進(jìn)行下述試驗。

·動力試驗

·根狀生長試驗

·溶菌活性試驗

·蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗

　　蠟樣芽胞桿菌具有動力、強(qiáng)溶血、不形成根狀菌落，或不產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶。

蠟樣芽胞桿菌在4℃、pH4.3、鹽濃度18%的條件下仍能存活或生長。

通過高溫殺菌或適當(dāng)?shù)睦洳乜梢钥刂葡灅友堪麠U菌的增殖。