免疫熒光技術(shù)操作步驟

   2013-09-25 實(shí)驗(yàn)室資訊網(wǎng)293
核心提示:基本原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少,相對使用標(biāo)記抗體
 基本原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少,相對使用標(biāo)記抗體用量偏大。
試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
熒光標(biāo)記的抗體溶液:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 進(jìn)行稀釋
緩沖甘油:分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制
搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml)
有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊)
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 滴加 0.01mol/L,pH7.4 的PBS于待檢標(biāo)本片上,10min后棄去,使標(biāo)本保持一定濕度。
2. 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液,使其完全覆蓋標(biāo)本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),保溫一
30min
定時(shí)間(參考:30min)。
3. 取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 沖洗后,再按順序過 0.01mol/L,
pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不時(shí)振蕩。
4. 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度,一般可用“+”表示:
(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++
--++++)熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上,而各種對照顯示為(±)
或(-),即可判定為陽性。
 
注意事項(xiàng)
1. 對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋在 1:20-100 之
間,要自行摸索最佳梯度,建立最好的稀釋比例,抗體濃度過低,會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,
影響結(jié)果的觀察。
2. 染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時(shí)間可以從 10 min 到數(shù)
小時(shí),一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于 37℃可加強(qiáng)染色效果,
但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用 0-2℃的低溫,延長染色時(shí)間。低溫染
色過夜較 37℃30 min 效果好的多。
3. 為了保證熒光染色的正確性,首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對照,以排除某些非特異性熒光染
色的干擾。
(1)標(biāo)本自發(fā)熒光對照:標(biāo)本加 1-2 滴 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS。
(2)特異性對照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗
體。
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光, 待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽性染色。
4. 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過 3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長,熒光強(qiáng)度會逐漸下降。




 
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