病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

淋巴細(xì)胞培養(yǎng) (Lymphocyte culture) 正常成熟的淋巴細(xì)胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細(xì)胞卻能在體外持續(xù)傳代，這是病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的例證，也是分離出EBV的標(biāo)志。T淋巴細(xì)胞在加入T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(IL-2)后可在體外培養(yǎng)，為研究人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV、HTLV)提供了條件，HIV在T淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 物中增殖形成多核巨細(xì)胞。

2.動(dòng)物試驗(yàn) 這是最原始的病毒分離培養(yǎng)方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據(jù)各病毒對(duì)組織的親嗜性而定，可接種鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、腹腔或靜脈，例如嗜神經(jīng)病毒(腦炎病毒)接種鼠腦內(nèi)，柯薩奇病毒接種乳鼠(一周齡)腹腔或腦內(nèi)。接種后逐日觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作鑒定。

3.雞胚培養(yǎng) 用受精孵化的活雞胚培養(yǎng)病毒比用動(dòng)物更加經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi)，如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng)；但很多病毒在雞胚中不生長(zhǎng)。

(二)分離病毒的鑒定

1.病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征

(1)細(xì)胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖引起細(xì)胞退形性變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測(cè)性診斷(表80-4)。免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)斑點(diǎn)狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。

表80-4 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征

(2)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象(Hemadsorption phenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后24-48小時(shí)，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動(dòng)物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng)的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。

(3)干擾現(xiàn)象 (Interference phenomenon) 一種病毒感染細(xì)胞后可以干擾另一種病毒在該細(xì)胞中的增殖，這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒(如風(fēng)疹病毒)但能干擾以后進(jìn)入的病毒(如ECHO病毒)增殖，使后者進(jìn)入宿主細(xì)胞不再生產(chǎn)CPE。

2.病毒感染性的定量測(cè)定

空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU) 測(cè)定 這是一種測(cè)定病毒感染性比較準(zhǔn)確的方法。將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長(zhǎng)單層細(xì)胞的玻璃平皿或扁瓶中，當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當(dāng)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖后，每一個(gè)感染性病 毒顆粒在單層細(xì)胞中產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染細(xì)胞病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒(méi)有著色的“空斑”，清楚可見(jiàn)。由于每個(gè)空斑由單個(gè)病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來(lái)表示。

(2)50%致死量(LD50)或50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)的測(cè)定 本法可估計(jì)所含病毒的感染量。方法是測(cè)定病毒感染雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動(dòng)物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出50%感染量或50%組織細(xì)胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。

3.病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察 病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負(fù)染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組 織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。

4.血清學(xué)鑒定 用已知的診斷血清來(lái)鑒定。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可鑒定病毒科屬；中和試驗(yàn)或血凝搗蛋制試驗(yàn)可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，檢材來(lái)源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復(fù)期雙份血清作血清學(xué)試驗(yàn)，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。

三、病毒核酸及抗原的直接檢出

(一)直接檢出病毒核酸

1.核酸雜交(Nucleic acid hybridization) -臨床病毒學(xué)中報(bào)速診斷方法通常是檢測(cè)標(biāo)本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點(diǎn)雜交 (Dot hybridization) 廣泛用于檢測(cè)呼吸道標(biāo)本，尿標(biāo)本中的病毒核酸。標(biāo)本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結(jié)合到膜上，在原位進(jìn)行鹼變性處理后，有放射標(biāo)記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按鹼基到補(bǔ)原則結(jié)合成雙股，經(jīng)放射自顯影，陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)斑點(diǎn)狀雜交信號(hào)。含輪狀病毒的糞便標(biāo)本經(jīng)熱變性處理，點(diǎn)到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標(biāo)記探針做斑點(diǎn)雜交，敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補(bǔ)的DNA探針做斑點(diǎn)雜交。

目前核酸分子雜交不但用來(lái)檢測(cè)急性病 人標(biāo)本中的病毒DNA，也用于檢測(cè)不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標(biāo)本中的病毒DNA。

2.多聚酶鏈反應(yīng) (Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴(kuò)增法。先將待檢標(biāo)本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對(duì)人工合成的與模板DNA兩端各20個(gè)鹼基互補(bǔ)的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3�端引物向5�端延伸DNA鏈，經(jīng)20～40個(gè)循環(huán)，可使1個(gè)拷貝的核酸擴(kuò)增至106以上，經(jīng)瓊脂糖電泳，可見(jiàn)到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴(kuò)增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標(biāo)本，有較大應(yīng)用前景。

(二)直接檢測(cè)病毒抗原

1.免疫熒光(IF)技術(shù) 如前所述IF可用于細(xì)胞培養(yǎng) 病毒的鑒定，也適用檢測(cè)臨床標(biāo)本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標(biāo)記特異性抗體，檢測(cè)病毒抗原；間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的抗體與特異性抗體結(jié)合，從而間接識(shí)別抗原?？扇⊙屎砻撀浼?xì)胞，檢測(cè)呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或腦活檢標(biāo)本，檢測(cè)單純皰疹病毒抗原；取尿沉渣檢測(cè)巨細(xì)胞病毒抗原等。近年來(lái)使用單克隆抗體大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

2.免疫酶法(IEA) 原理與應(yīng)用范圍同免疫熒光技術(shù)，IEA是用酶(通常是過(guò)氧化物酶)取代熒光素標(biāo)記抗體，酶催化底物形成有色產(chǎn)物，在普通光學(xué)顯微鏡下清晰可見(jiàn)，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。

3.放射免疫測(cè)定法(RIA) 有競(jìng)爭(zhēng)RIA和因相RNA二種方法。競(jìng)急RIA是同位素標(biāo)記的已知抗原與標(biāo)本中未標(biāo)記的待檢抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體的試驗(yàn)，將形成的復(fù)合物分離出來(lái)，用放射免疫檢測(cè)儀測(cè)定放射活性，同時(shí)與系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標(biāo)本中的抗原，然后加入放射性標(biāo)記的特異性抗體與抗原結(jié)合，測(cè)定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測(cè)定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 先將特異性抗體包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉標(biāo)本中相應(yīng)抗原，然后加入酶標(biāo)特異性抗體，相應(yīng)抗原被夾在抗體之間，當(dāng)加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標(biāo)本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質(zhì)，已被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用。

此外，對(duì)難以分離培養(yǎng)，形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標(biāo)本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。

四、特異性抗體的檢測(cè)特異性抗體的檢測(cè)

病毒感染后通常誘發(fā)針對(duì)病毒一種或多種抗原免疫應(yīng)答，特異性抗體效價(jià)升高或lgM抗體出現(xiàn)有輔助臨床診斷的價(jià)值。

(一)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF) CF分二個(gè)階段：1.抗原與抗體(一個(gè)為已知，一個(gè)為待檢)混合，加入定量補(bǔ)體，若抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，則補(bǔ)體被消耗；2.在上述混合物中加入溶血素致敏的綿羊紅細(xì)胞，若補(bǔ)本已與抗原抗體復(fù)合物完全結(jié)合，沒(méi)有剩補(bǔ)體存在，那么綿羊紅細(xì)胞不會(huì)溶血，結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明待檢標(biāo)本中有特異性存在，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)血清標(biāo)本最高稀釋度為抗體的效價(jià)。反之為陰性結(jié)果。由于補(bǔ)體結(jié)合抗體產(chǎn)生早，消失快，適于診斷病毒近期感染。(表80-5)。

*此例的抗體效價(jià)升高4倍，有診斷意義。

(二)中和試驗(yàn)(NT) 在活體或活細(xì)胞內(nèi)測(cè)定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)：①須先測(cè)出病毒的半數(shù)致死量(LD50)或半數(shù)感染量(ID50)；②隨即取活病毒與被試血清按不同比例混合，放置1～2小時(shí)讓其充分中和；③將病毒與血清混合液注入各組動(dòng)物、雞胚或組織細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)培養(yǎng)；④根據(jù)動(dòng)物、雞胚死亡數(shù)或細(xì)胞病變的管數(shù)，計(jì)算出百分比(%)，然后再計(jì)算這些試驗(yàn)對(duì)象中的半數(shù)免于死亡或免于致病所需要的最少量血清(或最大量的病毒)，就是該血清的中和抗體效價(jià)(稱為50%終點(diǎn)的中和效價(jià))。診斷病毒性疾病時(shí)，須取病人雙份血清同時(shí)做對(duì)比試驗(yàn)，病后血清的中和抗體效價(jià)也必須超過(guò)病初血清4倍以上，才能確診(表23-6)。用此法鑒定病毒時(shí)，須將病毒分別與免疫血清及血清正常血清(對(duì)照)混合做對(duì)比試驗(yàn)，免疫血清比正常血清多中和50～100倍劑量的病毒，才能斷定是該病毒。、

表80-6 病人雙份血清的病毒中和試驗(yàn)結(jié)果(組織細(xì)胞培養(yǎng)的中和試驗(yàn))

說(shuō)明：
①TCID50=組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量。

②每種稀釋度接種4支組織細(xì)胞培養(yǎng)管；0=未出現(xiàn)細(xì)胞致病作用；+=出現(xiàn)細(xì)胞致病作用。

③此例的病后血清中和抗體效價(jià)比病初血清增高8倍，有診斷意義。

病毒中和抗體的特異性高，持續(xù)時(shí)間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長(zhǎng)期存在中和抗體，所以適用于流行病學(xué)調(diào)查或人群免疫水平研究，但因試驗(yàn)方法繁雜，耗用動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)較多，故一般不作常規(guī)使用。

(三)血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibition test,HIT)某些病毒(流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腦炎病毒等)能凝集紅細(xì)胞，而抗體與這些病毒結(jié)合后卻能阻止它們的凝集，若雙份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于診斷這類病毒感染。本法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、特異性高，常用于流行病學(xué)調(diào)查等。

(四)lgM捕捉ELISA 特異性lgM出現(xiàn)于病毒感染的早期或病毒感染的活動(dòng)期，因此可從急性期病人單份血清中檢出特異性lgM，這是病毒感染實(shí)驗(yàn)室早期診斷的可靠方法。實(shí)驗(yàn)中先用u鏈血清包被微培板孔，用以捕捉血清標(biāo)本中的lgM類抗體，再加入特異性病 毒抗原及酶標(biāo)抗體以證實(shí)特異性lgM的存在?，F(xiàn)已廣泛用于病毒病的早期診斷。在先天性感染中，lgM檢測(cè)有特殊意義，因lgM不能通過(guò)胎盤，新生兒血清中發(fā)現(xiàn)抗病毒lgM提示為宮內(nèi)感染。